Name: Качественный и количественный анализ продукции сидерофоров синегнойной палочки (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 9 s
Description: Узнайте метод количественной оценки сидерофоров, пиовердина и пиохелина у Pseudomonas aeruginosa с помощью спектрофотометрического анализа. Этот упрощённый протокол позволяет исследовать факторы вирулентности патогена.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Авторы выражают признательность за финансирование со стороны DBT - Biotechnology Teaching Program, DBT - BUILDER Program и FIST. MR благодарит за стипендию, полученную от SHODH. Компания HP выражает благодарность за стипендию, полученную от CSIR.

Все бактериальные изоляты P. aeruginosa были получены из медицинских микробиологических лабораторий в Вадодаре и Джайпуре, Индия. Все отобранные клинические изоляты обрабатывались в шкафу биобезопасности (BSL2), и во время экспериментов применялась максимальная осторожность при обращении с бактериальными изолятами. Подробная информация обо всех реагентах/растворах приведена в таблице материалов.
1. Приготовление красителя и агаровой среды на основе сульфоната хрома (CAS)
<ol><li>Приготовьте краситель CAS (100 мл) со следующим составом:<ol><li>Растворите 60 мг CAS в 50 мл дистиллированной воды (раствор 1).</li>
		<li>Растворить 2,7 мг FeCl3·6H2Oв 10 мл 10 мМ HCl (раствор 2).</li>
		<li>Растворите 73 мг бромида цетримония (HDTMA) в 40 мл дистиллированной воды (раствор 3).</li>
		<li>Тщательно перемешайте Раствор 1, Раствор 2 и Раствор 3. Хранят его в стеклянной бутылке.</li>
	</ol></li>
	<li>Приготовьте агар CAS, выполнив следующие действия:<ol><li>Добавьте 100 мл раствора соли MM9 в 750 мл дистиллированной воды.</li>
		<li>Растворить 32,24 г пиперазина-N,N'-бис(2-этансульфоновой кислоты) (PIPES) свободной кислоты.</li>
		<li>Добавить 15 г агар-агара. Отпаркуйте в автоклав и дайте ему остыть.</li>
		<li>Добавьте в смесь 30 мл стерильного раствора касаминокислоты и 10 мл стерильного 20% раствора глюкозы.</li>
		<li>Добавьте 100 мл красителя CAS, перемешайте и залейте в асептических условиях. ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовление среды MM9, раствора касаминокислоты и 8-гидроксихинолина приведено в Дополнительном файле 1. Буфер PIPES чувствителен к pH. Он не растворится до тех пор, пока не будет достигнут рН 5,6. Убедитесь, что pH постоянно контролируется, потому что, когда PIPES начнет растворяться в воде, это еще больше снизит pH. Экстракт Казаминокислоты с таким же объемом 3%-го 8-гидроксихинолина растворяют в хлороформе. Оставьте несмешивающийся раствор при температуре 4 °C примерно на 20 минут и осторожно соберите верхнюю фазу раствора, не нарушая нижнюю фазу.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Качественный анализ производства сидерофоров
<ol><li>Установите наружный диаметр600 нм равным 0,2 для 24 ч выращенных культур P. aeruginosa.</li>
	<li>Используя стерильную проволочную петлю, нанесите бактериальную культуру на агаровую пластину CAS.</li>
	<li>Инкубируют при 30 °C в течение 24 ч. ПРИМЕЧАНИЕ: Для разбавления бактериальной культуры можно использовать пептонную водную среду или 0,8% физиологический раствор. Если в течение 24 ч рост бактерий не наблюдается, инкубируют планшеты CAS в течение 48–72 ч.</li>
</ol>3. Количественная оценка общего количества сидерофоров
<ol><li>Повторно высейте 24-часовые культуры P. aeruginosa в пептонные водные среды после регулировки наружного диаметра600 нм до 0,25 и инкубируйте при 30 °C в течение 48 ч.</li>
	<li>Через 48 ч центрифугируют бактериальную культуру при 4650 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.</li>
	<li>После центрифугирования добавляют 100 мкл внеклеточной надосадочной жидкости в 96-луночный микротитровый планшет и добавляют к нему 100 мкл красителя CAS.</li>
	<li>Накройте тарелку алюминиевой фольгой и выдержите при комнатной температуре 20 мин.</li>
	<li>После инкубации снимают спектрофотометрические показания на длине волны 630 нм.</li>
	<li>Рассчитайте полученные результаты для количественной оценки общего количества сидерофоров в процентах сидерофорных единиц (PSU). ПРИМЕЧАНИЕ: Блок питания можно рассчитать как: [(Ar - As)/Ar] x 100 где, Ar = поглощение эталона при 630 нм, As = поглощение бесклеточной надосадочной жидкости образца. Для справки, краситель CAS следует добавлять в неинокулированную пептную водную среду. Наполните всю стеклянную посуду, такую как пробирки, колбы и т. д., 6 M HCl в течение 2 ч и дважды промойте ее дистиллированной водой, чтобы удалить следы железа.</li>
</ol>4. Количественная оценка пиовердина
<ol><li>Повторно инокулируют выращенные в течение 24 ч культуры P. aeruginosa в пептонные водные среды после регулировки наружного диаметра600 нм до 0,25 и инкубируют при 30 °C в течение 48 ч.</li>
	<li>Через 48 ч измерьте наружный диаметр600 нм роста бактерий, прежде чем продолжить.</li>
	<li>Центрифугируют бактериальную культуру при 4650 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.</li>
	<li>После центрифугирования добавляют 100 мкл бесклеточной надосадочной жидкости в 96-луночный микротитровый планшет и добавляют к нему 100 мкл 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0).</li>
	<li>Снятие спектрофотометрических показаний при наружном диаметре405 нм.</li>
</ol>5. Экстракция пиохелина и спектрофотометрия
<ol><li>Повторно высевать выращенные в течение 24 ч культуры P. aeruginosa в среду King's B (Дополнительный файл 1) после корректировки наружного диаметра600 нм до 0,25 и инкубировать при 30 °C в течение 24 ч.</li>
	<li>Через 24 ч принимают 100 мл культуры и центрифугируют при 4650 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.</li>
	<li>После центрифугирования добавляют в надосадочную жидкость 5 мл 1 М лимонной кислоты. Дважды экстрагируйте 50 мл этилацетата.</li>
	<li>Органическую фазу с сульфатом магния процеживают через шприцевой фильтр. Отфильтрованную органическую фазу хранить при температуре -20 °C.</li>
	<li>Снимают спектрофотометрические показания на длине волны 320 нм. ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку пиохелин является очень нестабильным соединением при комнатной температуре, выполняйте процесс экстракции на льду. Используйте стерильный шприц объемом 50 мл для разделения фильтра. Положите вату на кончик шприца и добавьте на нее 1 г сульфата магния. Закрепите стерильный шприцевой фильтр на кончике шприца и соберите фильтрат в стерильную пробирку.</li>
</ol>

Оценка продукции сидерофоров изолятами Pseudomonas aeruginosa

<ol><li>Wang, J., Pontopolous, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+iron+cellulatar+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of iron cellulatar metabolism.</a> Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).</li>
<li>Schalk, I., Perraud, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+and+its+multiple+strategies+to+access+iron%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron.</a> Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).</li>
<li>Ghssein, G., Ezzeddine, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+Pseudomonas+aeruginosa+metallophores%3A+Pyoverdine%2C+pyochelin+and+pseudopaline%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline.</a> Biology. 11 (12), 1711(2022).</li>
<li>Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+iron+homeostasis+in+pseudomonas+aeruginosa+and+emerging+therapeutics+directed+to+disrupt+this+vital+process%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process.</a> Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).</li>
<li>Dingemans, P., Cornelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+adapts+its+iron+uptake+strategies+in+function+of+the+type+of+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).</li>
<li>Lin, J., Cheng, J., Shen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pseudomonas+quinolone+signal+%28pqs%29%3A+Not+just+for+quorum+sensing+anymore%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).</li>
<li>Sass, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermicrobial+interaction%3A+Aspergillus+fumigatus+siderophores+protect+against+competition+by+pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).</li>
<li>Dao, K. -H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyoverdine+production+by+pseudomonas+aeruginosa+exposed+to+metals+or+an+oxidative+stress+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Ecological+Applications%22%5BJournal%5D)">Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent.</a> Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).</li>
<li>Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyoverdine+siderophores%3A+From+biogenesis+to+biosignificance%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance.</a> Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).</li>
<li>Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+of+the+nonribosomal+peptide+synthetase+pvdd+from+pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).</li>
<li>Geum-Jae-Jeong,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+virulence+attenuation+by+inhibiting+siderophore+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).</li>
<li>Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+between+apparently+redundant+iron-uptake+mechanisms+benefits+bacteria+in+changeable+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments.</a> Biological Sciences. 280 (1764), 20131055(2013).</li>
<li>Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isochorismate+synthase+%28pcha%29%2C+the+first+and+rate-limiting+enzyme+in+salicylate+biosynthesis+of+pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).</li>
<li>Schwyn, B., Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+chemical+assay+for+the+detection+and+determination+of+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores.</a> Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).</li>
<li>Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+blue+agar+cas+assay+for+siderophore+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology+%26+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Use of blue agar cas assay for siderophore detection.</a> Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).</li>
<li>Arora, N. K., Verma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+microplate+method+for+rapid+and+efficient+estimation+of+siderophore+produced+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%223+Biotech%22%5BJournal%5D)">Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria.</a> 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).</li>
<li>Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+microplate+method+%28biolog+mt2%29+for+detection+of+fusarium+fungicides+resistance%2Fsensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).</li>
<li>Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+biology+of+pyoverdines%2C+pseudomonas+primary+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores.</a> Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).</li>
<li>Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+metal+specificity+of+the+pseudomonas+aeruginosa+pyoverdine-iron+uptake+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway.</a> Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).</li>
<li>Brandel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+siderophore+of+pseudomonas+aeruginosa%3A+Physicochemical+characterization+of+the+iron%28iii%29%2C+copper+%28ii%29+and+zinc+%28ii%29+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Transactions%22%5BJournal%5D)">a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes.</a> Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).</li>
<li>Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, (2014).</li>
<li>Cunrath, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogen+pseudomonas+aeruginosa+optimizes+the+production+of+the+siderophore+pyochelin+upon+environmental+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges.</a> Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).</li>
<li>Ji, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+sensitive+LC%2FMS%2FMS+method+for+quantification+of+pyochelin+in+human+sputum+samples+from+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarkers+%26+Applications%22%5BJournal%5D)">A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients.</a> Biomarkers & Applications. 4 (1), 135(2019).</li>
<li>Visaggio, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+luminescent+biosensor+for+the+microvolumetric+detection+of+the+pseudomonas+aeruginosa+siderophore+pyochelin%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sensors%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin.</a> ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).</li>
<li>Miethke, M., Marahiel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siderophore-bases+iron+acquisition+and+pathogen+control%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).</li>
<li>Il, J. M. R., Lin, Y. -M., Lu, Y., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+and+syntheses+of+siderophores%2C+microbial+iron+chelators%2C+and+analogs+as+potential+drug+delivery+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents.</a> Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).</li>
</ol>

Авторам нечего раскрывать.

Этот протокол позволяет исследователям количественно определить общее количество сидерофоров и двух различных сидерофоров P. aeruginosa, а именно пиовердина и пиохелина, из бактериальной внеклеточной надосадочной жидкости. В анализе агаровых пластин CAS краситель CAS и ионы Fe3+ образуют комплекс. Когда бактерии производят сидерофоры, они гасят ионы Fe3+ из комплекса CAS-Fe3+, что приводит к изменению цвета вокруг роста бактерий. Это изменение приводит к появлению четкого оранжевого ореола вокруг роста бактерий14,15. Несмотря на то, что бактерии могут попадать непосредственно на агаровые пластины CAS, это может повлиять на общие результаты. Полосы большого количества бактериальных клеток могут создать широкий оранжевый ореол вокруг бактериального роста, в то время как использование меньшего количества бактериальных клеток может привести к узкой чистой зоне. Чтобы решить эту проблему, мы наметили равномерное количество бактериальных клеток, отрегулировав OD600. Привередливые бактерии могут показать результаты через 24 часа, в то время как медленно растущим бактериям может потребоваться более 72 часов, чтобы продемонстрировать производство сидерофоров.
Для количественного определения суммарных сидерофоров первоначально применялась классическая спектроскопия, которая требует значительного объема надосадочной жидкости для обнаружения сидерофоров, что делает ее нецелесообразной. Количественное определение общего количества сидерофоров в настоящее время проводится с использованием 96-луночного планшета с модифицированным CAS-анализом. Такой подход привел к сокращению использования реагентов, бактериальной надосадочной жидкости, времени и повышению точности по сравнению с традиционными спектроскопическими методами16. В других исследованиях также сообщалось об использовании микротитровых планшетов в качестве более эффективного метода, экономящего время17. Количественное определение общего количества сидерофоров с использованием микротитровой пластины оказалось эффективным подходом. В этом исследовании для исследования были отобраны 48-часовые бактериальные культуры, выращенные на средах, не содержащих железа. Также было проведено сравнительное исследование для оценки продукции сидерофоров в различных питательных средах, таких как бульон Лурии, бульон Лурии (экстрагированный 3% 8-гидроксихинолином), среда King's B (экстрагированная 3% 8-гидроксихинолином) и пептонная водная среда (экстрагированная 3% 8-гидроксихинолином). Было замечено, что пептонные водные среды демонстрируют наибольшее количество сидерофоров, и поэтому они были выбраны для дальнейших экспериментов. График, показывающий продукцию сидерофоров в различных питательных средах, включен в дополнительный рисунок 1.
Пиовердин может быть обнаружен и количественно определен с помощью спектрофлуориметрических показаний, но известно, что только пиовердин проявляет флуоресценцию. Пиовердин в комплексе с ионами Fe3+ не проявляет флуоресценции18,19. Для обнаружения и количественного определения пиовердина для исследования были отобраны культуры бактерий возрастом 48 часов. Известно, что P. aeruginosa продуцирует пиохелин в начальных условиях голодания железа и переключается на производство пиовердина после воздействия тяжелых условий стресса железа. Было показано, что пиовердин может хелатировать другие катионы металлов, такие как алюминий, галлий, марганец и хром, но только железо успешно транспортируется к клеточной мембране19.
Подобно тотальным сидерофорам и пиовердину, пиохелин не может быть напрямую количественно определен из внеклеточного надосадочной жидкости и должен быть экстрагирован с помощью дихлорметана20. Дихлорметан не смешивается с бесклеточным надосадочным раствором и образует отдельный слой на дне. В этом исследовании были протестированы различные питательные среды, включая бульон Лурия, пептонную воду и среду с казаминными кислотами, но значительное количество пиохелина было получено из среды King's B. В то время как Hoegy et al. использовали среду CAA в своем протоколе, мы модифицировали ее с помощью среды King's B, поскольку среда CAA не поддерживала рост бактерий21. Метод был дополнительно модифицирован путем экстракции питательных сред с помощью 8-гидроксихинолина для удаления любых остатков железа из среды, создавая среду с дефицитом железа. Кроме того, было обнаружено, что время инкубации значительно влияет на выработку пиохелина. Dumas et al. продемонстрировали, что P. aeruginosa переключается с пиохелина на пиовердин в тяжелых условиях, ограничивающих железо12. В этом исследовании экстракцию и детекцию пиохелина проводили из бактериальных культур с 24-часовой возрастом, так как пиохелин не был обнаружен в 48-часовых культурах. Объем надосадочной жидкости также влияет на обнаружение пиохелина, поэтому для экстракции использовали 100 мл бесклеточной надосадочной жидкости. Кроме того, продукция пиохелина была значительно выше в изолятах MR1, TL7 и J3, возможно, из-за бактериальных штаммов, которые не могут продуцировать пиовердин, несмотря на наличие мощных хелаторов железа22.
Ji et al. представили новый и чувствительный подход к количественному определению пиохелина, валидировав его с помощью ЖХ/МС/МС. Однако этот метод применялся только к изолятам P. aeruginosa из мокроты пациентов с муковисцидозом. ЖХ/МС/МС, будучи дорогостоящей установкой, может оказаться недоступной для большинства лабораторий23. Visaggio et al. разработали биолюминесцентный биосенсор на основе цельных клеток, который обеспечивает быстрое, чувствительное и одноэтапное количественное определение пиохелина. Тем не менее, этот метод не может обеспечить количественное определение общего количества сидерофоров и пиовердина24.
Сидерофорные системы поглощения железа могут иметь противомикробное применение при доставке лекарств для бактерий с множественной лекарственной устойчивостью, поскольку они играют решающую роль в выживании и вирулентности бактерий. Этот подход может предложить новый способ борьбы с бактериями с множественной лекарственной устойчивостью25. Лекарственные средства, которые не могут проникнуть через клеточную мембрану бактерий, могут быть связаны с сидерофором, и полученный комплекс Fe-сидерофора может транспортироваться внутри бактериальной мембраны26.

Организмы нуждаются в железе для выполнения различных жизненно важных функций, таких как перенос электронов ирепликация ДНК. Известно, что Pseudomonas aeruginosa, грамотрицательный условно-патогенный патоген, обладает различными факторами вирулентности для установления инфекции в организме хозяина, одним из механизмов которых является образование сидерофора2. В условиях истощения железа P. aeruginosa высвобождает специализированные молекулы, называемые сидерофорами, которые гасят железо из окружающей среды. Сидерофоры хелатируют железо внеклеточно, и образующийся железо-сидерофорный комплекс активно транспортируется обратно в клетку3.
Известно, что P. aeruginosa продуцирует два сидерофора: пиовердин и пиохелин. Известно, что пиовердин обладает более высоким хелатным сродством железа (1:1), тогда как пиохелин, как известно, имеет меньшее хелатное сродство железа (2:1)4. Пиохелина также называют вторичным сидерофором, потому что он имеет более низкое хелатное сродство железа5. У P. aeruginosa6 производство и регулирование сидерофоров активно контролируется системами Quorum Sensing (QS).
Помимо гашения железа, сидерофоры также участвуют в регуляции факторов вирулентности и играют активную роль в образовании биопленки7. Сидерофоры играют дополнительную важную роль, включая участие в клеточной сигнализации, защите от окислительного стресса и содействии взаимодействию между микробными сообществами8. Сидерофоры обычно классифицируются в зависимости от конкретных функциональных групп, через которые они хелатируют железо. Тремя основными бидентатными лигандами в этой классификации являются катехолат, гидроксамат и α-гидроксикарбоксилат3. Пиовердины являются отличительными признаками флуоресцентных видов Pseudomonas, таких как P. aeruginosa и P. fluorescens5. Они состоят из смешанного зеленого флуоресцентного хромофора, соединенного с олигопептидом, содержащим 6-12 аминокислот. В их синтезе участвуют несколько нерибосомных пептидных синтетаз (NRP)9. Четыре гена, участвующие в производстве и регуляции пиовердина, — это pvdL, pvdI, pvdJ и pvdD10. Пиовердин также отвечает за инфекцию и вирулентность у млекопитающих11. Отмечается, что P. aeruginosa продуцирует пиохелин в условиях умеренного ограничения железа, в то время как пиовердин вырабатывается в тяжелых железолимитирующих средах12. Два оперона, участвующих в выработке пиохелина, — это pchDCBA и pchEFGHI13. Отмечено, что в присутствии пиоцианина пиохелин (катехолаты) индуцирует окислительное повреждение и воспаление и генерирует гидроксильные радикалы, которые вредны для тканей хозяина11.
Анализ на сульфонат азурола хрома (CAS) широко применяется благодаря его полноте, высокой чувствительности и большему удобству по сравнению с микробиологическими анализами, которые, хотя и чувствительны, могут быть чрезмерно специфичными14. Анализ CAS может проводиться на поверхности агара или в растворе. Он основан на изменении цвета, которое происходит, когда ион трехвалентного железа переходит от своего интенсивного синего комплекса к оранжевому. Колориметрический анализ CAS количественно определяет истощение железа из тройного комплекса Fe-CAS-поверхностно-активного вещества. Этот конкретный комплекс, состоящий из металла, органического красителя и поверхностно-активного вещества, имеет синий цвет и демонстрирует пик поглощения на длине волны 630 нм.
В настоящем докладе представлен метод качественного детектирования продукции сидерофоров, при котором можно обнаружить образование сидерофоров на агаровой пластине. Также предложен метод количественной оценки суммарной продукции сидерофоров в микротитровой пластине, а также детекции и количественного анализа двух сидерофоров, пиовердина и пиохелина, из P. aeruginosa.

<table><tbody><tr><td>Агар Агар, тип I</td><td>HIMEDIA</td><td>GRM666</td><td></td></tr><tr><td>8-гидроксихинолин</td><td>Loba Chemie</td><td>4151</td><td></td></tr><tr><td>Касаминовая кислота</td><td>SRL Химикаты</td><td>68806</td><td></td></tr><tr><td>Цетилтриметиламмония бромид (CTAB)</td><td>HIMEDIA</td><td>RM4867-100G</td><td></td></tr><tr><td>Хлороформ</td><td>Merck</td><td>1070242521</td><td></td></tr><tr><td>хрома азуролсульфонат</td><td>HIMEDIA</td><td>RM336-10G</td><td></td></tr><tr><td>Лимонная кислота</td><td></td><td>Merck 100241</td><td></td></tr><tr><td>Моногидрат декстрозы</td><td>Merck</td><td>108342</td><td></td></tr><tr><td>Дихлорметан</td><td>Merck</td><td>107020</td><td></td></tr><tr><td>Гексагидрат хлорида железа</td><td>HIMEDIA</td><td>GRM6353</td><td></td></tr><tr><td>стеклянные колбы</td><td>Borosil</td><td>5100021</td><td></td></tr><tr><td>стеклянные пробирки</td><td>Borosil</td><td>9820U05</td><td></td></tr><tr><td>Соляная кислота</td><td>SDFCL</td><td>20125</td><td></td></tr><tr><td>Королевская среда B База</td><td>HIMEDIA</td><td>M1544-500G</td><td></td></tr><tr><td>M9 Минимальная средняя соль</td><td>HIMEDIA</td><td>G013-500G</td><td></td></tr><tr><td>Сульфат магния&nbsp;</td><td>Qualigens</td><td>10034</td><td></td></tr><tr><td>MultiskanGO УФ-спектрофотометр</td><td>Thermo Scientific</td><td>51119200</td><td></td></tr><tr><td>пептон типа I, бактериологический</td><td>HIMEDIA</td><td>RM667-500G</td><td></td></tr><tr><td>PIPES свободные кислоты</td><td>MP Biomedicals</td><td>190257</td><td></td></tr><tr><td>дигидрофосфат калия</td><td>Merck</td><td>1048731000</td><td></td></tr><tr><td>пептон протеозы</td><td>HIMEDIA</td><td>RM005-500G</td><td></td></tr><tr><td>УФ-Вид спектрофотометр Shimadzu</td><td></td><td>2072310058</td><td></td></tr><tr><td>Sigma Laborzentrifuge</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3-18K</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Qualigens</td><td>15915</td><td></td></tr></tbody></table>

Качественный и количественный анализ продукции сидерофоров синегнойной палочки

Qualitative and Quantitative Analysis of Siderophore Production from Pseudomonas aeruginosa

Синегнойная палочка (P. aeruginosa) известна тем, что вырабатывает разнообразный спектр факторов вирулентности для установления инфекций в организме хозяина. Одним из таких механизмов является поглощение железа путем производства сидерофоров. P. aeruginosa продуцирует два различных сидерофора: пиохелин, который имеет более низкое железо-хелатное сродство, и пиовердин, который имеет более высокое железо-хелатное сродство. Этот отчет демонстрирует, что пиовердин может быть непосредственно количественно определен из бактериальных надосадочных растворов, в то время как пиохелин должен быть извлечен из надосадочной жидкости перед количественным определением.
Основным методом качественного анализа производства сидерофоров является анализ агаровых пластин на основе хром-азурола сульфоната (CAS). В этом анализе высвобождение красителя CAS из комплекса Fe3+-Dye приводит к изменению цвета с синего на оранжевый, что указывает на образование сидерофора. Для количественного определения общего количества сидерофоров бактериальные надосадочные жидкости смешивали в равных пропорциях с красителем CAS в микротитровой пластине с последующим спектрофотометрическим анализом при длине волны 630 нм. Пиовердин определяли непосредственно из бактериальной надосадочной жидкости путем смешивания его в равных пропорциях с 50 мМ Tris-HCl с последующим спектрофотометрическим анализом. Пик на длине волны 380 нм подтвердил наличие пиовердина. Что касается Пиохелина, то прямое количественное определение из бактериальной надосадочной жидкости было невозможно, поэтому его пришлось сначала экстрагировать. Последующий спектрофотометрический анализ выявил присутствие пиохелина с пиком на 313 нм.

Перед количественным определением сидерофоров из клинических изолятов был проведен качественный скрининг на продукцию сидерофоров, чтобы обеспечить получение сидерофоров. Качественное обнаружение сидерофоров из клинических изолятов наблюдалось по полосатым бактериям на агаровых пластинах CAS. Для исследования были выбраны три клинических изолята, а именно MR1, TL7, J3, а также PAO1 (референтный штамм). Все три клинических изолята и PAO1 показали положительные результаты в отношении продукции сидерофоров, где четкий оранжевый ореол вокруг роста бактерий на поверхности голубого агара указывал на положительную продукцию сидерофора (рис. 1). Образование ореола на агаре CAS (рис. 1) дало приблизительную оценку продукции сидерофоров клиническими изолятами. Проведена количественная оценка продукции сидерофоров с использованием реагента CAS и жидких сред.
Количественное определение общего сидерофора проводили непосредственно из бесклеточной надосадочной жидкости. После инкубации наблюдалось изменение цвета, где желтый цвет указывал на удаление красителя CAS из Fe-комплекса. Здесь в качестве контроля использовали краситель CAS с неинокулированной питательной средой, который был взят для расчета сидерофоров. Не было выявлено существенной разницы в общей продукции сидерофоров в изолятах MR1 и TL7, в то время как в J3 наблюдалась значительная общая продукция сидерофоров по сравнению с PAO1 (рис. 2).
Затем количественное определение пиовердина проводили непосредственно из внеклеточных надосадочных растворов. Пиовердины высвобождаются в клеточной среде, поэтому для количественного определения пиовердина использовали внеклеточную надосадочную жидкость. Также было выполнено сканирование УФ-диапазона спектрофотометром, где пик на длине волны 380 нм подтвердил наличие пиовердина (рис. 3А). Спектрофотометрические показания были сняты на длине волны 405 нм, а результаты интерпретированы как наружный диаметр405/наружный диаметр600 нм. Все изоляты показали продукцию пиовердина, где изоляты MR1 и J3 показали значительно более низкий уровень пиовердина по сравнению с PAO1, в то время как для TL7 существенных различий не наблюдалось (рис. 3B).
Пиохелин не может быть напрямую определен количественно из бесклеточной надосадочной жидкости. Извлечь пиохелин из 1 мл бесклеточной надосадочной жидкости не представлялось возможным, поэтому его экстрагировали из 100 мл бесклеточной надосадочной жидкости. Его подкисляли 1 М лимонной кислотой. Поскольку пиохелин является крайне нестабильным соединением, процесс экстракции проводился на льду. Обнаружение пиохелина проводилось путем сканирования УФ-диапазона в диапазоне от 300 до 600 нм, где пик на ОД320 нм подтверждал присутствие пиохелина (рис. 4А). Количественное определение пиохелина проводили путем снятия спектрофотометрических показаний при наружном диаметре320 нм. Расчеты производились путем деления OD320/OD600. Изоляты MR1, TL7 и J3 показали значительно более высокую продукцию пиохелина по сравнению с референтным изолятом PAO1 (рис. 4B).
Для проверки количества суммарных сидерофоров, образующихся в различных питательных средах, была проведена сравнительная продукция сидерофоров в различных питательных средах. Были выбраны четыре различные среды, в которых бульон Лурия, среда King's B и пептонная вода экстрагировались 3% 8-гидроксихинолином, а для исследования был выбран неэкстрагированный бульон Лурия. Не было существенной разницы между продукцией сидерофоров в экстрагированном бульоне Лурии, среде King's B и пептонной водной среде, в то время как существенная разница наблюдалась для продукции сидерофоров в неэкстрагированном бульоне Лурии.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig1v2.jpg"> Рисунок 1: Производство сидерофоров на агаре CAS. Рост P. aeruginosa на агаровых пластинах CAS-24-часовых выращенных культур выявляли на агаровых планшетах CAS и инкубировали при 30 °C в течение 24 ч. На присутствие сидерофора указывает оранжевый ореол вокруг колонии бактерий (PAO1, MR1, TL7 и J3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig1v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig2v2.jpg"> Рисунок 2: Общее производство сидерофоров. Общая продукция сидерофоров оценивалась для PAO1 и трех клинических изолятов (MR1, TL7 и J3). 100 мкл бесклеточной надосадочной жидкости (PAO1, MR1, TL7 и J3, выращенных в течение 24 ч в пептонном водном бульоне) добавляли в 96-луночный микротитровый планшет, после чего к нему добавляли 100 мкл красителя CAS. Для статистической значимости был проведен односторонний тест ANOVA. Столбцы погрешности представляют ± стандартное отклонение (SD) между тремя биологическими репликатами. *соответствует .&lt; 0,05; ns соответствует p &gt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig2v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig3v2.jpg"> Рисунок 3: Производство пиовердина. Продукцию пиовердина штамма P. aeruginosa PAO1 и клинических изолятов (MR1, TL7 и J3) оценивали после 24 ч роста в пептонной водной среде. Бактериальные культуры центрифугировали, и 100 мкл бесклеточной надосадочной жидкости добавляли в 96-луночный микротитровый планшет. После этого к нему добавляли 100 мкл 50 мМ Tris-HCl (рН 8,0). Детектирование пиовердина проводили методом УФ-спектрофотометрии в диапазоне от 350 нм до 600 нм. Спектрометрический анализ при 380 нм продукции пиовердина (А). Количественная оценка производства пиовердина (В). Столбцы погрешности показывают стандартную ошибку по отношению к среднему значению тройных экспериментов. Полосы погрешности представляют ± SD между тремя биологическими репликатами. соответствует p &lt; 0,0001, ** соответствует p &lt; 0,01, а ns соответствует p &gt; 0,05 на основе одностороннего критерия ANOVA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig3v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig4v2.jpg"> Рисунок 4: Производство Пёхелина. Пиохелиновое производство PAO1 (используется в качестве эталона) и клинических изолятов (MR1, TL7 и J3) с использованием экстракции этилацетатом и сульфатом магния. Спектрофотометрический анализ в диапазоне от 230 нм до 400 нм (А). Количественное определение пиохелина (В). Для каждого изолята было проведено три независимых эксперимента. Полосы погрешности представляют ± SD между тремя биологическими репликатами. соответствует p &lt; 0,001 на основе одностороннего теста ANOVA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig4v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Дополнительный рисунок 1: Сравнительная продукция сидерофоров в различных питательных средах бактерий. Общее производство сидерофоров в четырех различных питательных средах, где были отобраны среда King's B, пептонная водная среда и бульон Лурии с 3% 8-гидроксихинолином, чтобы удалить из него любые следы железа, и бульон Лурии (неэкстрагированный). Экстракцию 3%-ным 8-гидроксихинолином проводили путем добавления равного объема 3%-ного 8-гидроксихинолина в среду. Полосы погрешности представляют ± SD между тремя биологическими репликатами. **соответствует p &lt; 0,001, а ns соответствует p &gt; 0,5 на основе одностороннего теста ANOVA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/Supplemental%20Figure%201.pdf" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Дополнительный файл 1: Рецепты СМИ, использованные в настоящем исследовании. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть файл.</a>

Этот протокол обеспечивает как качественный, так и количественный анализ общего количества сидерофоров, пиовердина и пиохелина синегнойной палочки.

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is known for its production of a diverse range of virulence factors to establish infections in the host. One such ...

Сидерофоры образуют комплексы с железом и транспортируют его в клетку в железолимитирующих условиях. Сидерофоры являются мощными факторами вирулентности, которые помогают установить тяжелую инфекцию у хозяина и, как известно, играют роль в регулировании чувства кворума у Pseudomonas aeruginosa. Целью нашего исследования является количественная оценка продукции сидерофоров у синегнойной палочки.Сидерофоры являются внеклеточными молекулами, поэтому общие сидерофоры, наряду с пиовердином и пиохелином, количественно определяются с помощью внеклеточной надосадочной жидкости. Поскольку пиохелин не обнаруживается в малом объеме, экстракцию проводят из большого объема бесклеточной надосадочной жидкости. В последнее время для количественного определения пиохелина были разработаны ЛКМ и биосенсоры.LCMS является дорогостоящей установкой для небольших лабораторий, в то время как биосенсоры способны количественно определять только пиохелина. Этот простой и иллюстрированный протокол использует минимальное количество лабораторных реагентов и приборов и позволяет оценить сидерофор из внеклеточной надосадочной жидкости с меньшими затратами времени.

qualitative-quantitative-analysis-siderophore-production-from

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Конкуренция у Streptococcus pneumoniae опосредована бактериоцинами, малыми антимикробными пептидами с ингибирующей активностью по отношению к пневмококку и другим родственным видам. Здесь мы описываем оптимизированный анализ бактериального наложения, который позволяет охарактеризовать активность бактериоцина и ингибирующий спектр, специфичный для бактериоцина иммунитет и обнаружение секретируемых пептидов, чувствительных к кворуму.

Использование наложения Пробирной для Качественно Измерьте бактериальной продукции и чувствительность к пневмококковой Бактериоцины

Здесь мы опишем протокол для экстракции метаболитов из золотистого стафилококка и их последующего анализа с помощью жидкостной хроматографии и масс - спектрометрии.

Тандем жидкостной хроматографии на основе подхода для анализа метаболитов<em&gt; Золотистый стафилококк</em

Мы представляем собой протокол для быстрого отбора экологических проб для потенциальных siderophore, способствуя биодоступность микроэлементов и оборот в наземных систем.

Высок объём Siderophore скрининг от проб окружающей среды: растительных тканей, сыпучих грунтов и ризосфере почвы

Здесь мы описываем состояние роста к культуре малый вариант колонии Pseudomonas aeruginosa. Мы также описываем два отдельных метода обнаружения и количественной оценки экзополисахарида альгината производства P. aeruginosa с использованием традиционной уронической кислоты карбазол анализа и альгината конкретных моноклональных антител (mAb) основе ELISA.

Культура Малой колонии Вариант Pseudomonas aeruginosa и Квантитация его Alginate

Мы описываем здесь протокол для характеристики белково-белковых взаимодействий между двумя сильно по-разному выраженными белками в живых Pseudomonas aeruginosa с использованием измерений FLIM-FRET. Протокол включает в себя бактерии штамма конструкций, бактерий иммобилизации, изображений и пост-изображения данных анализа процедур.

FLIM-FRET Измерения белково-белковых взаимодействий в живых бактериях.

Pseudomonas aeruginosa продуцирует рамнолипидные биоповерхностно-активные вещества. Тонкослойная хроматография обнаруживает и определяет долю моно- и дирамнолипидов, продуцируемых каждым штаммом. Количественное определение общего количества рамнолипидов включает в себя оценку эквивалентов рамнозы, присутствующих в этих биосурфактантах, экстрагированных из надосадочной жидкости культур с использованием метода орцинола.

Обнаружение и количественное определение моно-рамнолипидов и ди-рамнолипидов, продуцируемых Pseudomonas aeruginosa

Бактерии колонизируют ткани хозяина, которые различаются по биодоступности кислорода и железа, однако в большинстве подходов к изучению бактерий используется аэрированная, обогащенная среда. В этом протоколе описывается культивирование патогена человека Yersinia pseudotuberculosis при различных концентрациях железа и напряжении кислорода, а также количественная оценка активности системы секреции Yersinia III типа, которая является важным фактором вирулентности.

Количественная оценка активности секреционной системы Yersinia pseudotuberculosis III типа после железного голодания и анаэробного роста

В этой рукописи мы представляем комплексный протокол оценки выживаемости антибиотиков для Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus, трансформируя плазмиды в P. aeruginosa и S. aureus для создания репортерных штаммов и визуализации фенотипических вариантов, таких как персистенты, с помощью покадровой эпифлуоресцентной микроскопии.

Покадровая эпифлуоресцентная микроскопия гетерогенных фенотипов Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus

Rotorod тест используется для оценки состояния двигателя в ходьбе движение геми-Паркинсона крыс аналога.

Использование Rotorod как метод Качественный анализ Прогулка по Крыса

Это видео демонстрирует протокол для выделения ДНК из фиксированных формалином парафин материала. Это многодневных процедура, при которой ткань разделы deparaffinized с ксилол, регидратации с этанолом и обрабатывают протеиназы К, чтобы очистить и изолировать ДНК для последующего гена или конкретной генома анализа.

Экстракции ДНК из парафин материала для генетических и эпигенетических Анализы

Узнайте метод количественной оценки сидерофоров, пиовердина и пиохелина у Pseudomonas aeruginosa с помощью спектрофотометрического анализа. Этот упрощённый протокол позволяет исследовать факторы вирулентности патогена.

Качественный и количественный анализ продукции сидерофоров синегнойной палочки

Больше видео