Name: Мониторинг актина Разборка с покадровой микроскопии (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Узнайте, как собрать проточную камеру для микроскопии с использованием парафильма и термического запечатывания. Этот метод позволяет исследователям проводить визуализацию актина и других белков в реальном времени.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li> Построить проточную камеру, как показано на видео. Убедитесь, что уплотнение парафильмом является жесткой и использования мыть покровные. </li><li> Инкубируйте актин-связывающего агента в камере на 5-10. </li><li> Блок неспецифические участки связывания на стекло покровное с блокирующим белком. </li><li> Полимеризации актина в камере, проходя в G-актина в полимеризации буфера. </li><li> Вымывание Неполимеризованные актина путем пропускания свыше буфера. </li></ol>

Мониторинг актина Разборка с покадровой микроскопии

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Итак, сегодня я хочу показать вам, как сконструировать проточную камеру, камеру для слияния, предназначенную для визуализации на микроскопе с вертикальным освещением. Для этого я создаю два пространства с помощью пленки. Я беру парафильм и нарезаю его на узкие полоски.Далее я сформирую каналы для стенок и просушу их струей воздуха под наклоном. Я помещу покровное стекло поверх парафина, и вот результат. Затем я нагрею образец на термоблоке, чтобы расплавить парафин и обеспечить герметизацию.Перед нами покровное стекло, на котором, как видно здесь, расположены два слоя пленки. Сверху на них снова находится покровное стекло размером 22 на 22 мм. Вот оно, я прижал его к пленке, чтобы создать герметичную печать.Итак, жидкость поступает здесь в одном направлении, и я могу вытянуть ее с помощью фильтровальной бумаги в этом направлении. Я покажу вам, как это сделать, чуть позже. Обычно я помещаю образец в увлажненную камеру, устройство которой очень простое.Возьмите две приподнятые полоски и поместите под них фильтровальную бумагу. Чтобы избежать попадания пузырьков воздуха, накройте проточную камеру покровным стеклом. Для введения раствора в камеру просто приставьте наконечник пипетки к входу в камеру и медленно введите жидкость.Теперь я инкубирую камеру с закрытой крышкой в течение 10 минут. Чтобы удалить жидкость с другой стороны, я обычно использую фильтровальную бумагу, разрезанную на такие тонкие полоски. Я беру одну из этих полосок и одновременно ввожу раствор через вход, прикладывая фильтровальную бумагу к выходу, чтобы удалить заменяемый раствор.Таким образом, вы увидите, как жидкость проходит через раствор. Затем я жду пять минут до полного закрытия. Теперь я готов добавить актин; фактически мне необходимо полимеризовать актин, и я провожу полимеризацию непосредственно в проточной камере, используя те же процедуры, что и ранее.Таким образом, после того как актин полимеризовался, я вымываю весь избыток неполимеризованного актина, используя большой объем одного лишь буфера. Здесь у меня около 100 µL, что соответствует нескольким объемам реакционной камеры. Когда фильтровальная бумага насыщается, мне приходится менять направление. Хорошо?Теперь я готов приступить к визуализации. Перфузионная камера с прикрепленным к ней актином готова. Теперь я беру предметное стекло, помещаю его под микроскоп и, поскольку я провожу визуализацию с использованием масляного объектива, нанесу иммерсионное масло на верхнюю поверхность покровного стекла, чтобы оценить раствор, белок или любые другие вещества, взаимодействующие с актином внутри.Таким образом, я могу заменять раствор в рабочем канале непосредственно в процессе проведения таймлапс-визуализации.

monitoring-actin-disassembly-with-time-lapse-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Микроскопические изображения живых эндотелиальных клеток, экспрессирующих GFP-актин позволяет характеристике динамических изменений цитоскелета структур. В отличие от методов, которые используют фиксированных экземпляров, этот метод обеспечивает детальную оценку временных изменений в актина цитоскелета в тех же камерах до, во время и после различных физических, фармакологических, или воспалительные стимулы.

Изучение актинового цитоскелета в клетках эндотелия Живая выражая GFP-актин

Микротрубочки нестабильны полимеры и их переключение между ростом и сокращением является стохастической и трудно контролировать. Здесь мы опишем протокола с сегментированные микротрубочки с photoablatable стабилизирующих колпачками. Деполимеризация сегментированных микротрубочек могут быть вызваны с высоким временным и пространственным разрешением, тем самым способствуя анализ движений с разборки концах микротрубочек.

Подготовка сегментированных микротрубочек исследовать движение приводится в действие разборки микротрубочек Ends

Мы опишем, как микро - и добавлены методы, такие как FRAP и photoactivation включить определение параметров подвижности и пространственно-временных динамики белков внутри миграции клеток. Экспериментальная отсчетов включают субцеллюлярные динамика и оборот регуляторов подвижности или базовой Цитоскелет актина.

Микроманипуляции методы, позволяя анализ морфогенетических динамики и оборот цитоскелета регуляторов

Мы сообщаем о простом, эффективном по времени и высокопроизводительном флуоресцентном спектроскопии анализе для количественной оценки актиновых нитей в биологических образцах ex vivo из тканей мозга грызунов и людей.

Эффективный по времени анализ на основе флуоресцентной спектроскопии для оценки статуса полимеризации актина в тканях мозга грызунов и человека

Здесь представлен комплексный протокол для проведения сверхбыстрых экспериментов с силовым зажимом на процессивных двигателях миозина-5, который можно легко распространить на изучение других классов процессных двигателей. В протоколе подробно описаны все необходимые этапы, от настройки экспериментального аппарата до пробоподготовки, сбора и анализа данных.

Рассечение механоферментных свойств процессивных миозидов с помощью сверхбыстрой силово-зажимной спектроскопии

Мы представляем протоколы для простых микрофлюидных анализов актиновой нити в сочетании с флуоресцентной микроскопией, которые позволяют точно контролировать отдельные актиновые нити в режиме реального времени, последовательно подвергая их воздействию различных белковых растворов.

Использование микрофлюидики и флуоресцентной микроскопии для изучения динамики сборки одноактиновых нитей и пучков

Этот протокол описывает образование поддерживаемых липидных бислоев и добавление цитоскелетных нитей и моторных белков для изучения динамики восстановленных, мембранно-привязанных цитоскелетных сетей с использованием флуоресцентной микроскопии.

Восстановление мембранно-привязанных минимальных актиновых коры на поддерживаемых липидных бислоях

Этот протокол является руководством для визуализации динамических актинов и микротрубочек с использованием микроскопического анализа in vitro полной внутренней флуоресценции (TIRF).

Визуализация динамики связи актина и микротрубочек in vitro с помощью флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF)

В данной работе представлены протоколы для проектирования и характеристики перестраиваемых трехмерных композитных сетей совместно запутанных актиновых нитей и микротрубочек. Композиты подвергаются активной реструктуризации и баллистическому движению, приводимому в действие двигателями миозина II и кинезина, и настраиваются относительными концентрациями актина, микротрубочек, моторных белков и пассивных сшивающих факторов.

Восстановление и характеристика актин-микротрубочных композитов с перестраиваемой динамикой и механикой с приводом от двигателя

В этой работе используется подход восстановления in vitro для изучения пороэластичности гелей актомиозина в контролируемых условиях. Количественно определена динамика геля актомиозина и встроенного растворителя, с помощью которой продемонстрирована сетчатая пороупругость. Мы также обсуждаем экспериментальные проблемы, распространенные ошибки и отношение к механике клеточного цитоскелета.

Механика (поро-)эластичных сократительных сетей актомиозина как модельная система клеточного цитоскелета

Здесь мы представляем методы получения квазидвумерных (2D) запутанных, сшитых и жидкокристаллических актиновых сборок из очищенных белков.

Настройка режимов сократимости и деформации активных сборок на основе актина in vitro: от двумерных активных сетей до жидкокристаллических капель

Узнайте, как собрать проточную камеру для микроскопии с использованием парафильма и термического запечатывания. Этот метод позволяет исследователям проводить визуализацию актина и других белков в реальном времени.

Мониторинг актина Разборка с покадровой микроскопии

Больше видео