Мониторинг актина Разборка с покадровой микроскопии
8 ноября 2006 г.
Итак, сегодня я хотел бы показать вам, как построить проточную камеру, термоядерную камеру для визуализации на вертикальном микроскопе. Затем я создаю два пространства с помощью пленки. Итак, что я делаю: я беру парапленку, разрезаю ее на маленькие полоски.
Далее я собираюсь, это в основном сформирует каналы для стен, и я вытираю их под наклоном воздуха. Я положил крышку на верхнюю часть пара, И вот и все готово. Затем я нагреваю его на нагревательном блоке, чтобы расплавить параметр и создать уплотнение.
Итак, вот это, покровное стекло здесь, а затем поверх покровного стекла два слоя фима, как вы видите здесь. И в довершение ко всему, опять же, это крышка размером 22 на два миллиона метров. Вот этот прямо здесь, который я прижал к параметру, чтобы упасть печать.
Итак, жидкость поступает в одном направлении здесь, и я могу отсосать ее с помощью фильтровальной бумаги здесь в этом направлении. И я покажу вам, как это сделать чуть позже. Так что мне нравится помещать его в увлажненную камеру, что очень просто.
Возьмите два вида приподнятых полосок и держите под ними фильтр из бумаги. И чтобы он был шумным, как я, я надеваю крышку, крышку на проточную камеру. Теперь способ введения решения в камеру заключается в том, что вы просто помещаете наконечник пипетки у входа в камеру и просто расщепляете.
Теперь я инкубирую камеру с закрытой крышкой в течение 10 минут. Что я обычно делаю, чтобы отсосать жидкость с другой стороны, так это использую ее, беру фильтровальную бумагу и нарезаю ее тонкими полосками, вот так. И я беру одну из этих тонких полосок и одновременно наношу раствор во вход, при этом кладу фильтровальную бумагу на выходе, чтобы отсосать обмен, раствор.
Таким образом, вы увидите, как жидкость протекает через раствор. А затем я жду пять минут до середины закрытия. Теперь я готов к тому, что актин и актин мне нужно полимеризовать, я полимеризуюсь внутри проточной камеры, и это те же самые процедуры, которые были раньше.
Потому что вот так, и теперь, когда действие полимеризовалось, я вымываю все ненужные неполимеризованные действия, используя большой объем буфера. Итак, у меня есть около ста микролитров, и это несколько объемов буфера в реакционной камере. Просто, знаете, когда фильтровальная бумага пропитывается, мне приходится менять направление. Хорошо?
И поэтому я готов сделать визуализацию с помощью этого. Так перфузионная камера с присоединенным к ней актином. Теперь я беру предметное стекло, помещаю его под микроскоп, и поскольку я делаю снимки с помощью масляного объектива, я собираюсь нанести немного иммерсионного масла на верхнюю поверхность крышки, на траву, например, оценить раствор или белок или что-то еще, действующее внутри.
Итак, что я делаю, так это могу поменять сторону решения, пока делаю покадровую съемку. Как таковой.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье показано изготовление поточной камеры и камеры слияния для визуализации на вертикальном микроскопе. Процесс включает создание каналов с использованием паралифа и их герметизацию при помощи тепла.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология
Фон
- Поточные камеры необходимы для различных методов визуализации.
- Конструирование камеры слияния позволяет улучшить возможности визуализации.
- Паралиф широко используется в лабораторных условиях для создания уплотнений.
- Понимание процесса конструирования важно для исследователей в этой области.
Цель исследования
- Предоставить пошаговое руководство по изготовлению поточной камеры.
- Проиллюстрировать использование паралифа для создания камер визуализации.
- Улучшить доступность методов визуализации для исследователей.
Используемые методы
- Резка паралифа на полосы для формирования каналов.
- Сушка полос с помощью наклонного потока воздуха.
- Наложение покровного стекла на паралиф.
- Нагревание сборки на блоке нагрева для создания герметичности.
Основные результаты
- Была успешно изготовлена функциональная поточная камера.
- Процесс герметизации оказался эффективным для создания стабильной среды для визуализации.
- Продемонстрированный метод может быть воспроизведен для лабораторного использования.
- Исследователи могут использовать эту технику для различных визуализационных приложений.
Выводы
- Конструирование поточных и камер слияния является простым.
- Этот метод может способствовать продвинутым исследованиям в области визуализации.
- Доступ к таким методам может улучшить результаты исследований.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This protocol enables reproducible preparation of controlled microenvironments for live-cell imaging, supporting mechanistic studies of cytoskeletal dynamics. By standardizing flow chamber assembly, it reduces variability in perfusion-based assays, improving data consistency across discovery teams. The method facilitates quantitative analysis of actin disassembly kinetics, a key process in cell motility and signal transduction relevant to target validation in oncology and immunology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct observation of actin depolymerization dynamics to interrogate regulators of cytoskeletal remodeling.
- Operational Value: Provides a standardized platform for testing compound effects on actin turnover in live cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports development of fluorescence-based readouts for actin disassembly rates as a functional assay endpoint.
- Operational Value: Allows solution exchange during time-lapse imaging to assess dose-response relationships under perfusion.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links actin dynamics to cellular phenotypes relevant to metastasis, invasion, and immune synapse formation.
- Operational Value: Enables preclinical assessment of pathway inhibitors using quantifiable imaging biomarkers.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement screening to functional validation in disease-relevant cellular systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cytoskeletal regulators through real-time visualization of actin flux.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible measurements of actin disassembly under controlled perfusion conditions.
- Analytics: Generates time-resolved fluorescence intensity data enabling kinetic modeling of actin turnover.
- Translational Research: Connects molecular mechanism to cellular phenotypes in preclinical models of cell migration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable perfusion platform adaptable to multiple cytoskeletal targets and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of targets involved in actin regulation through direct functional readouts.
- Operational Value: Standardized chamber preparation improves assay reproducibility across sites and operators.
- Strategic Value: Enables earlier go/no-go decisions by linking target modulation to functional cytoskeletal outcomes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on cell motility and invasion phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and microfluidic flow control.
- Depends on access to upright microscopes with environmental control and perfusion capabilities.
- Necessitates standardization of parafilm thickness and sealing parameters for chamber-to-chamber consistency.
- Adaptation to different cell types may require optimization of surface coating and actin polymerization conditions.
- Practical limitations include potential shear stress effects on cells during prolonged perfusion, as noted in the protocol.
