Применение монослойного графена в решетках криоэлектронной микроскопии для определения структуры с высоким разрешением
10 ноября 2023 г.
Применение опорных слоев к сеткам криогенной электронной микроскопии (криоЭМ) может увеличить плотность частиц, ограничить взаимодействие с границей раздела воздух-вода, уменьшить движение, индуцированное лучом, и улучшить распределение ориентаций частиц. В данной работе описан надежный протокол покрытия криоЭМ-решеток монослоем графена для улучшения подготовки криообразцов.
Распространенной проблемой при подготовке образцов для криоэлектронной микроскопии является локализация частиц на границе раздела воздух-вода, в результате чего частицы принимают предпочтительную ориентацию и денатурируются. Вместо этого лучше, чтобы частицы лежали на поверхности сетки, которую поддерживает тонкая пленка, как это способствует графен. Еще одной проблемой является требование относительно высоких концентраций образцов, которые также могут быть решены с помощью графена.
Сетки с графеновым покрытием обеспечивают множество преимуществ для определения структуры криоЭМ, но исторически сложилось так, что их было трудно изготовить собственными силами, а также непомерно дорого приобрести в коммерческих целях. Этот протокол позволяет надежно осаждать монослойный графен, тем самым снижая барьер для пользователей, использующих эти сетки в своих исследованиях. Графен уникален из-за свойств своего материала.
Он представляет собой монослой углерода и поэтому проявляет минимальный фоновый шум. Другие носители криоЭМ-сетки, такие как тонкий слой хлопьев аморфного углерода или оксида графена, не могут быть применены в виде одного монослоя и вносят больший фоновый сигнал. Теперь, когда мы создали надежный протокол для применения графена в криоЭМ-сетках, мы хотели бы продолжить функционализацию сеток с графеновым покрытием с аффинными ручками для захвата непосредственно из клеточных лизатов.
Это могло бы устранить еще одно узкое место в подготовке криоЭМ-образцов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В этой статье представлен протокол покрытия сеток для криогенной электронной микроскопии (криоЭМ) монослоем графена. Использование графена увеличивает плотность частиц, минимизирует взаимодействия с воздушно-водным интерфейсом и улучшает распределение ориентации частиц.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Криогенная электронная микроскопия
- Науки о материалах
- Техники подготовки образцов
Предыстория
- Локализация частиц на воздушно-водном интерфейсе является обычной проблемой в криоЭМ.
- Предпочтительные ориентации могут привести к денатурации частиц.
- Подложки из графена могут помочь частицам оставаться на поверхности сетки.
- Исторически, изготовление сеток, покрытых графеном, было сложным и дорогостоящим процессом.
Цель исследования
- Предоставить надежный протокол для нанесения монослоя графена на сетки криоЭМ.
- Снижение барьеров для исследователей в использовании сеток, покрытых графеном.
- Усиление преимуществ структурного определения в криоЭМ.
Использованные методы
- Разработка протокола покрытия графеном.
- Оценка плотности и ориентации частиц.
- Сравнение сеток, покрытых графеном, с традиционными сетками.
- Оценка воспроизводимости в изготовлении сеток.
Основные результаты
- Сетки, покрытые графеном, значительно улучшают локализацию частиц.
- Повышенная плотность частиц позволяет лучше определять структуру.
- Надежный протокол облегчает внутрилабораторное изготовление сеток с графеном.
- Снижение затрат и улучшение доступности для исследователей.
Выводы
- Использование графена в сетках криоЭМ позволяет решить ключевые задачи в подготовке образцов.
- Этот протокол способствует более широкому использованию сеток, покрытых графеном, в исследованиях.
- Уникальные свойства графена улучшают возможности криоЭМ.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Sample preparation bottlenecks in cryo-electron microscopy (cryoEM) limit the throughput and reliability of high-resolution structure determination in early discovery and structural biology pipelines. The application of monolayer graphene to cryoEM grids addresses critical challenges of particle localization, orientation bias, and sample concentration requirements, directly impacting predictive confidence in target validation and mechanistic studies. Robust, reproducible graphene grid protocols enable broader enterprise adoption, supporting risk-adjusted portfolio advancement and efficient resource allocation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-fidelity structural interrogation of macromolecular targets at near-atomic resolution.
- Reduces sample denaturation and orientation bias, supporting mechanistic de-risking.
- Facilitates confident target validation by improving particle density and imaging consistency.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized, reproducible grid supports for downstream cryoEM workflows.
- Improves assay reliability by minimizing background noise and enhancing quantitative imaging outputs.
- Supports scalable screening of structurally diverse complexes at lower sample concentrations.
Translational & Preclinical Research
- Enables structural studies of disease-relevant complexes, supporting translational biomarker alignment.
- Provides continuity from discovery-stage structure elucidation to preclinical validation of molecular mechanisms.
- Reduces risk of late-stage biological failure by ensuring structural data quality.
Pipeline & Workflow Integration
Monolayer graphene grid preparation integrates into the cryoEM workflow from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis-driven structure determination and mechanistic insight.
- Discovery Biology: Supports robust null hypothesis testing by enabling accurate structural comparisons across conditions.
- Screening: Delivers reproducible, low-background grids for quantitative imaging and assay standardization.
- Analytics: Provides high-quality diffraction patterns and density maps for statistical analysis and decision-making.
- Translational Research: Maintains structural data continuity for disease-relevant targets and complexes.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reproducible grid preparation capability for diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural studies.
- Operational Value: Standardizes grid preparation, enhances reproducibility, and lowers sample input requirements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing sample preparation bottlenecks.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in graphene handling and cryoEM grid preparation.
- Needs access to spin coaters, glow discharge units, and UV ozone cleaners.
- Demands cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for different macromolecular systems or sample types.
- Practical limitations include handling fragility and ensuring monolayer integrity during transfer.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:35
Preparing MMA‐Coated CVD Graphene for Fabrication of Graphene‐Coated CryoEM Grids
3:27
Preparing Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares for Attaching to CryoEM Grids
5:14
Fabricating Graphene‐Coated Cryo‐EM Grids Using Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares
