Генерация клеточной линии RIP1 Knockout U937 с использованием системы CRISPR-Cas9

Наше исследование сосредоточено на программе клеточной смерти млекопитающих, в частности, на изучении баланса между апоптозом и некроптозом в контексте гипергликемии. Совсем недавно было показано, что киназа белка клеточной смерти RIP1 модулирует экспрессию генов во время некроптоза. В настоящее время наша экспериментальная задача заключается в генетической манипулировании иммунными клетками, которые растут во взвешенном состоянии, в частности, в нокауте гена киназы RIP1 с помощью CRISPR-Cas9.

Наш протокол имеет два явных преимущества. Он улучшает методы трансфекции иммунных клеток, которые растут в суспензии с использованием лентивируса, и устраняет необходимость клонирования одной клетки в процессе создания генетического нокаута с помощью CRISPR-Cas9. Наши результаты проложили путь к изучению роли киназы RIP1 в гипергликемическом сдвиге при некроптозе. Для начала полосу квадрантной полосы Escherichia coli, содержащую лентивирусный вектор, направляет РНК на агаровые пластины Лурии-Бертани или LB, дополненные 100 микрограммами на миллилитр ампициллина.

Инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного-двух дней, пока отдельные колонии не станут видны в наиболее разбавленном участке планшета. После инкубации с помощью стерильной петли выберите одну колонию и добавьте в нее пять миллилитров бульона LB, дополненного 100 микрограммами на миллилитр ампициллина в конической трубке объемом 50 миллилитров. Прокрутите и заклейте скотчем крышку трубки.

Инкубируйте трубку в орбитальном вибростенде при температуре 37 градусов Цельсия и 225 оборотах в минуту в течение восьми часов. Тем временем добавьте 40 миллилитров бульона LB, дополненного 100 микрограммами на миллилитр ампициллина, в четыре пробирки по 50 миллилитров. После инкубации переложите по 40 микролитров выращенной культуры в каждую из четырех пробирок.

Проветрьте и заклейте скотчем крышки пробирок перед их инкубацией в орбитальном вибростенде при температуре 37 градусов Цельсия и 225 об/мин в течение 12–16 часов. На следующий день центрифугируйте культуры при давлении 3, 220 х г в качающемся роторе ведра в течение 20 минут. Сцедите надосадочную жидкость в стакан для отходов и соедините все четыре гранулы в 10 миллилитрах бульона LB, дополненного ампициллином.

Центрифугируйте комбинированные гранулы на максимальной скорости в вращающемся роторе ковша в течение 20 минут, чтобы получить одну гранулу и сбросить как можно больше надосадочной жидкости в стакан для отходов. Засейте HEK293T клетки в концентрации от трех до пяти умножить на 10 в степени шести клеток в колбу Т25, содержащую DMEM. Инкубируйте колбу в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом.

Тем временем приготовьте трансфективную смесь с использованием соотношения плазмид 1:1:1:1 и реагента для трансфекции 3:1 к плазмидной ДНК с восстановленной сывороточной средой. Смешайте 75 микролитров реагента для трансфекции, 2 500 микролитров восстановленной сывороточной среды и 25 микрограммов общей плазмидной ДНК. Дайте смеси настояться при комнатной температуре от 15 до 30 минут.

Далее тщательно пипетируйте трансфекционную смесь на сливающиеся HEK293T клетки в колбе, содержащей среду. Осторожно взболтайте колбу, чтобы обеспечить достаточную гомогенизацию смеси, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 48 часов. После двух дней инкубации переложите среду из продуцента HEK293T клеточной колбы в коническую пробирку объемом 15 миллилитров.

Центрифугируйте пробирку при давлении 800 x g в течение пяти минут, чтобы удалить оставшиеся HEK293T ячейки. Тщательно удалите весь вируссодержащий надосадочную жидкость, не потревожив гранулу и переложите ее в новую коническую трубку объемом 15 миллилитров. Посчитайте и рассчитайте необходимый объем суспензии ячеек U937, чтобы получить гранулу 2 х 10 в степени шести ячеек.

Затем центрифугировать клеточную суспензию в 15-миллилитровой пробирке при давлении 400 х г в течение 10 минут и сцедить надосадочную жидкость, оставив клеточную гранулу в пробирке. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в надосадочную жидкость, содержащую вирус, и центрифугируйте пробирку при давлении 290 x g в течение 60 минут. После центрифугирования с помощью пипетки повторно суспендируйте гранулу с вируссодержащим надосадочной жидкостью в пробирке.

Поместите трубку на вращатель из конца в конец на 60 минут. Затем центрифугируйте пробирку при давлении 400 x g в течение 10 минут и повторно суспендируйте гранулу в соотношении 1:1 с вирусом, содержащим надосадочную жидкость и полную среду RPMI 1640, дополненную 10% инактивированным теплом FBS. Перенесите клеточную смесь в новую колбу для культуры тканей T25 и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 48 часов.

После инкубации центрифугируйте клетки U937 при 400 х g в течение 10 минут и удалите надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу полным фильтрующим материалом RPMI 1640, дополненным 10% инактивированным теплом FBS и пятью микрограммами пуромицина на миллилитр. Перенесите культуру клеток в колбу T25.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух-трех недель, проверяя клетки каждые один-два дня на наличие признаков роста. Вестерн-блоттинг подтвердил потерю экспрессии белка RIP1 в мутантных клетках RIP1 CRISPR без обнаруживаемого сигнала по сравнению с сильным сигналом в контрольных клетках дикого типа и нецелевых контрольных клетках. Лечение TCZ вызывало значительную гибель некроптотических клеток в контрольных клетках дикого типа и нецелевых клеток, которая была обращена вспять при лечении некростатином-1s.

Напротив, нокаутирующие клетки RIP1 CRISPR показали значительно меньшую гибель клеток по сравнению с дикими типами и нецелевыми контрольными клетками без эффекта некростатина-1, что указывает на потерю функции RIP1. Флуоресцентная микроскопия живых клеток показала значительное увеличение продукции митохондриального супероксида в диких и нецелевых контрольных клетках после лечения TCZ, которое было снижено при лечении некростатином-1s. Нокаутные клетки RIP1 CRISPR демонстрировали минимальную продукцию митохондриального супероксида без наблюдаемого эффекта обработки некростатином-1.