Выделение первичных пигментных эпителиальных клеток сетчатки свиньи для моделирования in vitro
3 мая 2024 г.
В этом протоколе описывается процедура получения и культивирования первичных клеток пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) из глаз свиней местного происхождения. Эти клетки служат высококачественной альтернативой стволовым клеткам и подходят для исследований сетчатки in vitro .
Мы разрабатываем модели заболеваний, имитирующие аспекты патологий сетчатки. С помощью этих моделей мы можем лучше понять роль клеток RPE в заболеваниях, основываясь на их реакции на физические изменения, например, когда возникает нагрузка на монослой или мембрана брекса утолщается с возрастом. Одной из самых больших проблем является наличие репрезентативного типа клеток.
По сравнению с широко используемой иммортализированной клеточной линией, первичные клетки, выделенные с помощью этого метода, делают наши модели заболеваний более реалистичными для того, что происходит в наших глазах. Этот метод позволяет получить клетки высокого качества, не требуя длительного времени дифференцировки. Кроме того, мы используем ресурсы, которые являются общедоступными для исследовательских лабораторий, что делает их более рентабельными.
Двигаясь вперед, мы хотим рассмотреть, как естественные изменения, происходящие в глазах во время старения, могут привести к ранним стадиям ВМД. Мы хотим лучше понять эти изменения, чтобы определить конкретные цели лечения.
Обзор
Данное исследование посвящено выделению и культивированию первичных клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ) из глаз свиньи для совершенствования исследований сетчатки in vitro. Этот метод позволяет создавать высокорепрезентативные модели заболеваний, которые имеют решающее значение для понимания патологий сетчатки.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Биология клеток сетчатки
- Моделирование заболеваний in vitro
- Старение и дегенерация сетчатки
Теоретическая часть
- Значимость клеток РПЭ для здоровья сетчатки
- Проблемы использования иммортализованных клеточных линий
- Потребность в экономически эффективных и высококачественных источниках клеток
Используемые методы
- Выделение и культивирование клеток РПЭ из свиных глаз
- Использование энуклеированных свиных глаз из источников, прошедших проверку USDA
- Методы культивирования клеток in vitro и работа со средами
Основные результаты
- Высококачественные клетки РПЭ, изолированные с характерной пигментацией
- Клетки достигли полной конфлюэнтности в течение одной недели
- Регулярный мониторинг морфологии и отсутствия контаминации клеток
Выводы
- В данном протоколе представлен эффективный метод культивирования клеток РПЭ, который является жизнеспособной альтернативой использованию стволовых клеток.
- Результаты данного исследования имеют важное значение для изучения возрастной макулярной дегенерации (ВМД) и других заболеваний сетчатки.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Доступ к физиологически релевантным клеткам ретинального пигментного эпителия (РПЭ) является критическим узким местом в разработке офтальмологических препаратов и моделировании заболеваний. Изоляция первичных клеток РПЭ свиньи представляет собой масштабируемую и экономически эффективную альтернативу клеткам человеческих доноров или клеткам, полученным из иПСК, что позволяет создавать более прогностические модели in vitro для исследований на ранних стадиях. Данный подход повышает уверенность в трансляционной значимости результатов и обосновывает решения по формированию портфеля программ по изучению заболеваний сетчатки.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать механизмы заболеваний, вызванных РПЭ, в биологически релевантной системе.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем моделирования естественных реакций РПЭ на стрессоры и старение.
- Способствует механистическому снижению рисков для мишеней при заболеваниях сетчатки, обеспечивая контекст первичных клеток.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает валидированный источник первичных клеток для разработки воспроизводимых методов анализа.
- Повышает стандартизацию анализа и надежность количественных результатов по сравнению с иммортализованными линиями.
- Позволяет проводить скрининг соединений в системе с характеристиками РПЭ, приближенными к условиям in vivo.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит модели заболеваний in vitro в соответствие с патофизиологией сетчатки человека для трансляционных исследований биомаркеров.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации за счет сохранения фенотипов клеток, релевантных данному заболеванию.
- Снижает риск отсева на поздних этапах из-за использования нерепрезентативных клеточных моделей.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный протокол первичного выделения клеток РПЭ находится на стыке этапов ранних открытий и разработки доклинических моделей, восполняя пробел между исследованиями, основанными на гипотезах, и трансляционной валидацией.
- Фундаментальная биология: позволяет проверять гипотезы о функционировании РПЭ и прогрессировании заболеваний в условиях, приближенных к естественным.
- Скрининг: обеспечивает получение первичных клеток, готовых к анализу, для оценки соединений и изучения механизмов действия.
- Аналитика: поддерживает количественное измерение состояния, конфлюэнтности и морфологии РПЭ для проведения сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: предоставляет платформу для согласования биомаркеров и моделирования заболеваний, имеющих значение для ВМД у людей и сопутствующих патологий.
- Корпоративное использование: предлагает воспроизводимый, масштабируемый источник клеток, подходящий для использования в различных программах исследований сетчатки.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую уверенность и снижает механистическую неопределенность в исследованиях заболеваний сетчатки.
- Операционная ценность: оптимизирует доступ к высококачественным первичным клеткам, снижая зависимость от дефицитных или медленно дифференцирующихся источников.
- Стратегическая ценность: улучшает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала на ранних этапах разработки офтальмологических препаратов.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритезацию мишеней и моделей сетчатки для дальнейшего продвижения с учетом оценки рисков.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с культурами тканей и стандартная лабораторная инфраструктура.
- Необходим доступ к свежим глазам свиньи от коммерческих или академических поставщиков.
- Стандартизация условий выделения и культивирования имеет решающее значение для воспроизводимости результатов.
- Может потребоваться адаптация под конкретные требования анализа или моделирования заболеваний.
- Мониторинг контаминации и морфологической достоверности необходим для обеспечения целостности данных.
