Визуализация белков с низкой распространенностью и посттрансляционных модификаций в живых эмбрионах дрозофилы с помощью инъекции флуоресцентных антител
19 января 2024 г.
Этот протокол описывает индивидуальную флуоресцентную мечение на основе антител и инъекцию в ранние эмбрионы дрозофилы , чтобы обеспечить живую визуализацию белков с низкой распространенностью или посттрансляционных модификаций, которые трудно обнаружить с помощью традиционных подходов GFP/mCherry-tag.
Мы стремимся понять, как механические и биохимические сигналы коррелируют морфогенез животных, включая обнаружение и реакцию на силы со стороны клеток и молекул. Было обнаружено, что все больше молекул являются механочувствительными, функционирующими по-разному при различных уровнях напряжения. Тем не менее, физиологический контекст и функции этих чувствительных к силе событий остаются в значительной степени неизвестными.
Из-за динамической природы событий, чувствительных к силе, наша область в значительной степени полагается на высокоскоростную флуоресцентную визуализацию и интервальную запись для регистрации молекулярного и клеточного поведения. Многие флуоресцентно меченные белки недостаточно яркие, чтобы их можно было визуализировать, и это требует пространственно-временного разрешения без значительного отбеливания. С другой стороны, традиционные иммунофлуоресцентные методы могут получить только моментальный снимок молекулярного и клеточного фиксатора после фиксации.
Этот метод прокладывает путь к динамическому отслеживанию локализации многих белковых рецепторов с низкой распространенностью основных сигнальных путей, таких как Notch, Wnt и BMP. В конце концов, в дополнение к традиционным линейным сигнальным каскадам, мы можем точно определить, где происходят сигнальные события на субклеточном уровне.
Обзор
Данное исследование сосредоточено на изучении того, как механические и биохимические сигналы координируют морфогенез животных. В работе освещаются сложности, возникающие при детектировании белков с низкой концентрацией и посттрансляционных модификаций в процессе визуализации живых объектов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биохимия
- Клеточная биология
Теоретические основы
- Механические и биохимические сигналы имеют решающее значение для морфогенеза.
- Многие молекулы являются механочувствительными и по-разному реагируют на натяжение.
- Физиологический контекст событий, чувствительных к силе, в значительной степени не изучен.
- Высокоскоростная флуоресцентная визуализация необходима для изучения динамического поведения клеток.
Цель исследования
- Для усиления детекции белков с низкой экспрессией в живых эмбрионах Drosophila.
- Для совершенствования методов визуализации по сравнению с традиционными подходами.
- Для изучения физиологической роли механочувствительных молекул.
Используемые методы
- Специализированное флуоресцентное мечение на основе антител.
- Инъекции в эмбрионы Drosophila на ранних стадиях развития.
- Методы прижизненной визуализации для регистрации динамических процессов.
- Таймлапс-запись для наблюдения за поведением молекул.
Основные результаты
- Успешное мечение и визуализация белков с низкой экспрессией.
- Продемонстрирована эффективность нового протокола визуализации.
- Получены данные о поведении механочувствительных молекул.
- Выявлены ограничения традиционных методов иммунофлуоресценции.
Выводы
- Данный протокол обеспечивает лучшую визуализацию труднодоступных белков.
- Он открывает новые возможности для изучения клеточных ответов на механические сигналы.
- Будущие исследования могут опираться на эти результаты для дальнейшего изучения морфогенеза.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Детекция белков с низкой экспрессией и посттрансляционных модификаций в живых системах остается сложной задачей на ранних этапах разработки лекарственных средств, что ограничивает понимание механизмов действия и валидацию мишеней. Протокол флуоресцентного мечения с помощью антител позволяет в режиме реального времени визуализировать динамику эндогенных белков и ПТМ в живых эмбрионах Drosophila, преодолевая ограничения по чувствительности и возникновение артефактов, характерных для традиционных методов тегирования и фиксации. Эта возможность повышает точность прогнозов на этапах валидации мишеней и снижения рисков, связанных с механизмами действия, что способствует принятию более обоснованных решений по формированию портфеля препаратов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Обеспечивает прямую визуализацию малораспространенных сигнальных белков и ПТМ в физиологически значимых контекстах.
- Способствует снижению механистических рисков, выявляя пространственные и временные закономерности локализации и модификации белков.
- Повышает прогностическую достоверность оценки взаимодействия с мишенью и анализа сигнальных путей в живых модельных системах.
Скрининг и разработка анализа
- Способствует разработке количественных методов анализа живых клеток для изучения динамики локализации и модификации белков.
- Предоставляет платформу для проверки специфичности антител и соотношения сигнал/шум в рабочих процессах визуализации живых клеток.
- Обеспечивает воспроизводимое детектирование динамических молекулярных событий, имеющих решающее значение для последующего скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- При применении к сигнальным путям позволяет сопоставлять результаты визуализации живых систем с механизмическими биомаркерами, имеющими значение для заболевания.
- Обеспечивает преемственность от этапа поиска до доклинической валидации за счет мониторинга молекулярных событий в режиме реального времени.
- Снижает трансляционные риски, предоставляя физиологически точные данные о динамике белков и посттрансляционных модификаций (PTM).
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол введения антител и прижизненной визуализации интегрирован в процесс перехода от ранних этапов поиска к идентификации ведущих соединений, обеспечивая связь между валидацией мишени и разработкой доклинических моделей.
- Открывающая биология: позволяет проверять гипотезы о функциях белков и активности сигнальных путей в живых эмбрионах.
- Скрининг: обеспечивает количественные и воспроизводимые данные о локализации белков и ПТМ для разработки анализов.
- Аналитика: поддерживает измерения молекулярной динамики с временным разрешением, что облегчает сравнение условий и механистический анализ.
- Трансляционные исследования: открывают возможности для согласования биомаркеров в сигнальных путях, имеющих значение при заболеваниях.
- Корпоративное повторное использование: метод адаптируемы для других мишеней антител и совместим с различными моделями или клеточными линиями, подходящими для инъекций.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неоднозначность при валидации мишеней.
- Операционная ценность: стандартизирует визуализацию белков с низкой экспрессией и ПТМ в живых клетках с высокой чувствительностью.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать более обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя физиологически релевантные молекулярные данные в режиме реального времени.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение мишеней с подтвержденной механистической ролью.
Рекомендации по реализации
- Требуется опыт в области микроинъекций, визуализации живых объектов и конъюгации антител.
- Необходим доступ к флуоресцентной микроскопии высокого разрешения и инструментам для прецизионного манипулирования эмбрионами.
- Стандартизация протоколов маркировки антител и инъекций имеет решающее значение для воспроизводимости результатов.
- Адаптация метода для других модельных систем может потребовать оптимизации параметров инъекции и визуализации.
- Детекция сигнала зависит от специфичности антител и эффективности маркировки.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:33
Fluorescent Labeling of Antibodies for Imaging Low Abundance Proteins in Drosophila
2:18
Preparation and Alignment of Drosophila Embryos for Injecting Fluorescently Labeled Antibodies
4:56
Injecting Fluorescently Labeled Antibodies in Live Drosophila Embryos and Imaging of Low Abundance Proteins
