Визуализация белков с низкой распространенностью и посттрансляционных модификаций в живых эмбрионах дрозофилы с помощью инъекции флуоресцентных антител

Этот протокол описывает индивидуальную флуоресцентную мечение на основе антител и инъекцию в ранние эмбрионы дрозофилы , чтобы обеспечить живую визуализацию белков с низкой распространенностью или посттрансляционных модификаций, которые трудно обнаружить с помощью традиционных подходов GFP/mCherry-tag.

Мы стремимся понять, как механические и биохимические сигналы коррелируют морфогенез животных, включая обнаружение и реакцию на силы со стороны клеток и молекул. Было обнаружено, что все больше молекул являются механочувствительными, функционирующими по-разному при различных уровнях напряжения. Тем не менее, физиологический контекст и функции этих чувствительных к силе событий остаются в значительной степени неизвестными.

Из-за динамической природы событий, чувствительных к силе, наша область в значительной степени полагается на высокоскоростную флуоресцентную визуализацию и интервальную запись для регистрации молекулярного и клеточного поведения. Многие флуоресцентно меченные белки недостаточно яркие, чтобы их можно было визуализировать, и это требует пространственно-временного разрешения без значительного отбеливания. С другой стороны, традиционные иммунофлуоресцентные методы могут получить только моментальный снимок молекулярного и клеточного фиксатора после фиксации.

Этот метод прокладывает путь к динамическому отслеживанию локализации многих белковых рецепторов с низкой распространенностью основных сигнальных путей, таких как Notch, Wnt и BMP. В конце концов, в дополнение к традиционным линейным сигнальным каскадам, мы можем точно определить, где происходят сигнальные события на субклеточном уровне.