Name: Анализ для выявления защиты сосудистой сети сетчатки от смерти от диабета у мышей (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T14:05:00.000+00:00
Duration: 4 min 36 s
Description: Изучите защиту сосудистой сети сетчатки от диабетического повреждения у мышей с помощью нового анализа защиты. Этот метод помогает исследовать механизмы устойчивости сосудов к диабетической ретинопатии.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Эта работа была поддержана грантами Иллинойского общества по предотвращению слепоты, Национального института здравоохранения (EY031350 и EY001792) и неограниченным грантом Фонда исследований по предотвращению слепоты.

Исследование патогенеза диабетической ретинопатии с помощью нового анализа защиты сетчатки

<ol><li>Teo, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+of+diabetic+retinopathy+and+projection+of+burden+through+2045%3A+Systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Global prevalence of diabetic retinopathy and projection of burden through 2045: Systematic review and meta-analysis.</a> Ophthalmology. 128 (11), 1580-1591 (2021).</li>
<li>Lee, R., Wong, T. Y., Sabanayagam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+diabetic+retinopathy%2C+diabetic+macular+edema+and+related+vision+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+Vis+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of diabetic retinopathy, diabetic macular edema and related vision loss.</a> Eye Vis (Lond). 2, 21(2015).</li>
<li>Lima, V. C., Cavalieri, G. C., Lima, M. C., Nazario, N. O., Lima, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+for+diabetic+retinopathy%3A+A+case-control+study%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Retina+Vitreous%22%5BJournal%5D)">Risk factors for diabetic retinopathy: A case-control study.</a> Int J Retina Vitreous. 2, 21(2016).</li>
<li>Sabanayagam, C., Yip, W., Ting, D. S., Tan, G., Wong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+emerging+trends+in+the+epidemiology+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Ten emerging trends in the epidemiology of diabetic retinopathy.</a> Ophthalmic Epidemiol. 23 (4), 209-222 (2016).</li>
<li>Antonetti, D. A., Silva, P. S., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+of+the+molecular+and+cellular+pathology+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy.</a> Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).</li>
<li>Wong, T., Cheung, C., Larsen, M., Sharma, S., Simó, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Dis+Primers%22%5BJournal%5D)">Diabetic retinopathy.</a> Nat Rev Dis Primers. 2, 16012(2016).</li>
<li>Wu, M. Y., Yiang, G. T., Lai, T. T., Li, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+during+the+pathogenesis+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid+Med+Cell+Longev%22%5BJournal%5D)">The oxidative stress and mitochondrial dysfunction during the pathogenesis of diabetic retinopathy.</a> Oxid Med Cell Longev. 2018, 3420187(2018).</li>
<li>Hietala, K., Harjutsalo, V., Forsblom, C., Summanen, P., Groop, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+at+onset+and+the+risk+of+proliferative+retinopathy+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Age at onset and the risk of proliferative retinopathy in type 1 diabetes.</a> Diabetes Care. 33 (6), 1315-1319 (2010).</li>
<li>Aiello, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Diabetic retinopathy.</a> Diabetes Care. 21 (1), 143-156 (1998).</li>
<li>Klein, R., Klein, B. E., Moss, S. E., Davis, M. D., Demets, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wisconsin+epidemiologic+study+of+diabetic+retinopathy.+Prevalence+and+risk+of+diabetic+retinopathy+when+age+at+diagnosis+is+less+than+30+years%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The wisconsin epidemiologic study of diabetic retinopathy. Prevalence and risk of diabetic retinopathy when age at diagnosis is less than 30 years.</a> Arch Ophthalmol. 102 (4), 520-526 (1984).</li>
<li>Nathan, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+intensive+treatment+of+diabetes+on+the+development+and+progression+of+long-term+complications+in+insulin-dependent+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus.</a> N Engl J Med. 329 (14), 977-986 (1993).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustering+of+long-term+complications+in+families+with+diabetes+in+the+diabetes+control+and+complications+trial.+The+diabetes+control+and+complications+trial+research+group%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Clustering of long-term complications in families with diabetes in the diabetes control and complications trial. The diabetes control and complications trial research group.</a> Diabetes. 46 (11), 1829-1839 (1997).</li>
<li>Cruickshanks, K. J., Moss, S. E., Klein, R., Klein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+activity+and+proliferative+retinopathy+in+people+diagnosed+with+diabetes+before+age+30+yr%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Physical activity and proliferative retinopathy in people diagnosed with diabetes before age 30 yr.</a> Diabetes Care. 15 (10), 1267-1272 (1992).</li>
<li>Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+animal+models+of+diabetic+retinopathy%3A+From+molecular+approaches+to+mice+and+higher+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Update on animal models of diabetic retinopathy: From molecular approaches to mice and higher mammals.</a> Dis Model Mech. 5 (4), 444-456 (2012).</li>
<li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> J Neurophysiol. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li>
<li>Sergeys, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+in+vivo+characterization+of+the+streptozotocin-induced+diabetic+mouse+model%3A+Focus+on+early+inner+retinal+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Longitudinal in vivo characterization of the streptozotocin-induced diabetic mouse model: Focus on early inner retinal responses.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (2), 807-822 (2019).</li>
<li>Sun, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+from+retinopathy+and+other+complications+in+patients+with+type+1+diabetes+of+extreme+duration%3A+The+joslin+50-year+medalist+study%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Protection from retinopathy and other complications in patients with type 1 diabetes of extreme duration: The joslin 50-year medalist study.</a> Diabetes Care. 34 (4), 968-974 (2011).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slow+progression+of+diabetic+retinopathy+is+associated+with+transient+protection+of+retinal+vessels+from+death%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The slow progression of diabetic retinopathy is associated with transient protection of retinal vessels from death.</a> Int J Mol Sci. 24 (13), 10869(2023).</li>
<li>Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+digest+protocol+to+analyze+the+retinal+vasculature+of+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model.</a> J Vis Exp. 76, e50489(2013).</li>
<li>Veenstra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+retinopathy%3A+Retina-specific+methods+for+maintenance+of+diabetic+rodents+and+evaluation+of+vascular+histopathology+and+molecular+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mouse+Biol%22%5BJournal%5D)">Diabetic retinopathy: Retina-specific methods for maintenance of diabetic rodents and evaluation of vascular histopathology and molecular abnormalities.</a> Curr Protoc Mouse Biol. 5 (3), 247-270 (2015).</li>
<li>Zheng, L., Gong, B., Hatala, D. A., Kern, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ischemia+and+reperfusion+causes+capillary+degeneration%3A+Similarities+to+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal ischemia and reperfusion causes capillary degeneration: Similarities to diabetes.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (1), 361-367 (2007).</li>
<li>Mizutani, M., Kern, T. S., Lorenzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+death+of+retinal+microvascular+cells+in+human+and+experimental+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Accelerated death of retinal microvascular cells in human and experimental diabetic retinopathy.</a> J Clin Invest. 97 (12), 2883-2890 (1996).</li>
<li>Weerasekera, L. Y., Balmer, L. A., Ram, R., Morahan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+retinal+vascular+and+neural+damage+in+a+novel+model+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of retinal vascular and neural damage in a novel model of diabetic retinopathy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (6), 3721-3730 (2015).</li>
<li>Dagher, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+rat+and+human+retinas+predict+a+role+for+the+polyol+pathway+in+human+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 53 (9), 2404-2411 (2004).</li>
<li>Podestà, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bax+is+increased+in+the+retina+of+diabetic+subjects+and+is+associated+with+pericyte+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro.</a> Am J Pathol. 156 (3), 1025-1032 (2000).</li>
<li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinovascular+physiology+and+pathophysiology%3A+New+experimental+approach%2Fnew+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinovascular physiology and pathophysiology: New experimental approach/new insights.</a> Prog Retin Eye Res. 31 (3), 258-270 (2012).</li>
</ol>

У авторов нет конфликта интересов, о котором они могли бы сообщить.

В этом исследовании был установлен анализ для выявления резистентности/уязвимости сосудистой сети сетчатки к смерти, вызванной инсультами, связанными с СД/ДР, такими как ишемия/окислительный стресс и цитокины. В данной рукописи приводится подробное описание этого анализа, который является модификацией нескольких опубликованных протоколов 19,20,21.
Протокол включает в себя несколько важных этапов. Во-первых, необходимо скрупулезно рассечь сетчатку, обеспечив сохранность сосудистой сетки и предотвратив существенные разрывы. Этого можно достичь, сделав разрез на 2-3 мм позади лимба, так как сетчатка плотно прилегает к ora serrata, и ее разделение является сложной задачей. Во-вторых, покройте трипсином все инструменты, которые соприкасаются с сосудами (например, одноволосые щетки, пипетки и щипцы), окунув эти инструменты в раствор YL-трипсина на протяжении всей процедуры. Это предотвращает прилипание сосудистой сети к инструментам, которые используются в этом протоколе. В-третьих, поскольку микроциркуляторное русло почти незаметно при нормальном освещении, требуется повышенная бдительность во время аспирации мусора и его переноса на предметное стекло микроскопа, чтобы предотвратить случайную потерю.
Соответствующая степень ферментативного переваривания различных слоев сетчатки имеет решающее значение; Недостаточное пищеварение препятствует отделению нейрональной ткани от сосудистой сети, в то время как чрезмерное пищеварение растворяет сосудистое сплетение. Сообщалось о различном времени пищеварения в диапазоне от 1 ч19 до ночи 23 ч. По наблюдениям, время сбраживания 4 ч 15 мин дает наиболее благоприятные результаты по сравнению с продолжительностью 2 ч, 3 ч и 4 ч. Продление пищеварения после этой точки вряд ли ускорит процесс, а вместо этого может поставить под угрозу целостность сосудистой системы.
В тех случаях, когда переваренная сетчатка прилипает к одноволосой щетке, окуните волосы в раствор YL трипсина несколько раз. Это уменьшает липкие участки кисти. Если расческа все-таки прилипла к сосудистой ткани, то осмотрите ее на наличие остаточных фрагментов стекловидного тела, и удалите их щипцами.
Оптимальным моментом для полного удаления стекловидного тела является устранение фоторецепторов, но до удаления оставшейся нервной и глиальной ткани. Сетчатка сохраняет ригидность до тех пор, пока фоторецепторы не будут удалены. Извлечение стекловидного тела на этой стадии потенциально может привести к разрыву сетчатки/сосудистой сети. Нежные слои остаточной нервной и глиальной ткани играют ключевую роль в сохранении изогнутой формы сосудистой структуры. Они предотвращают разрыв сетчатки в ее центре, когда стекловидное тело отделено от зрительного нерва.
Если изолированная сосудистая сеть вообще не прилипает к предметному стеклу микроскопа, то это указывает на то, что участок предметного стекла, где ожидается адгезия, загрязнен. Попробуйте переместить сосуды по поверхности слайда, чтобы найти липкое место, переключиться на другой слайд или тщательно очистить слайд и повторить попытку. Если сосуды прилипают к горке до того, как они развернутся в форме чаши, поднимите сосудистую сеть из горки, чтобы позволить ей снова свободно плавать в воде. Проделайте этот шаг с помощью щипцов, которые были многократно окунуты в раствор трипсина YL.
Сообщалось о нескольких альтернативных методах изоляции сосудистой сети, которые не подходят для описанного здесь защитного анализа. Например, осмотический лизис был использован для выделения сосудистой сети из нефиксированных образцов сетчатки, что облегчало биохимические исследования ткани24,25. Тем не менее, эта процедура может не сохранить анатомию сосудистой сети, а также подход, использованный в этой статье. Аналогичным образом, в то время как метод тканевой печати для выделения больших сегментов микроциркуляторного русла позволяет проанализировать электротоническую архитектуру сосудистой сети26, все сосудистое русло, как правило, не восстанавливается.
Этот анализ был разработан в связи с тем, что существующие подходы к мониторингу капиллярной дегенерации не решают проблему защиты. Капиллярная дегенерация, возникающая после длительного СД, указывает на то, развилась ли ДР. В дополнение к диагностике ДР, этот результат полезен для оценки того, предотвращает ли препарат/терапия ДР. Тем не менее, существующие анализы капиллярной дегенерации не говорят о базовом механизме действия агента. Такой агент может предотвратить патологические события, которые приводят к ДР, такие как повышенный окислительный стресс или цитокины. Кроме того, агент может усиливать защиту, повышая устойчивость к окислительному стрессу и цитокинам и/или способствуя восстановлению повреждений. Этот новый защитный тест может быть использован для определения того, связан ли положительный эффект данной терапии с усилением эндогенной системы, которая защищает от смерти, связанной с СД.
Недостатком этого защитного теста является то, что он не различает два типа клеток в сосудах сетчатки: эндотелиальные клетки (ЭК) и перициты (ПК). Несмотря на то, что внешний вид их ядер на участках, окрашенных PASH, зависит от типа клетки (рис. 6), не каждое ядро проявляет диагностические признаки. Примерно 30% ядер не могут быть однозначно определены как ЕС или ПК, по крайней мере, частично, поскольку двумерные изображения, полученные из образцов, окрашенных PASH, не полностью разрешают трехмерную структуру сосудистого сплетения. Это препятствие может быть преодолено с помощью дополнительного анализа, такого как иммунофлуоресцентное окрашивание маркерами, специфичными для конкретного типа клеток. Такие изображения, которые различают два типа клеток, могут быть окрашены совместно с TUNEL для определения резистентности/уязвимости каждого из типов сосудистых клеток.
Этот сосудисто-фокусированный анализ не дает никакой информации о нервной сетчатке. Для получения такой информации могут быть разработаны дополнительные анализы. Например, вместо того, чтобы изолировать сосудистую сеть сетчатки, можно создать одноклеточную суспензию всей сетчатки, а затем проанализировать (путем флуоресцентной сортировки клеток) на резистентность/уязвимость. Включение специфичных для типа клеток маркеров (как нервных, так и сосудистых) наряду с индикаторами клеточной гибели позволило бы получить более полную картину типов клеток сетчатки, обладающих способностью к защите от СД/ЛУ-опосредованной смерти.
В заключение следует отметить, что описанный в данной статье защитный анализ обеспечивает мощный подход к изучению механизма, ответственного за задержку между началом СД и проявлением ДР у мышей.

Диабетическая ретинопатия (ДР) является одним из микрососудистых осложнений сахарного диабета (СД) и ведущей причиной слепоты у лиц трудоспособного возраста в развитых странах1. Основными факторами риска развития диабетической ретинопатии являются продолжительность и степень гипергликемии 2,3,4. В то время как СД вызывает дисфункцию как сосудистого, так и нервного компонентов сетчатки5, диагностика ДР основывается на морфологических особенностях сосудистой сети сетчатки6.
Окислительный стресс, индуцированный гипергликемией, является одним из факторов патогенеза ДР7. Повышенный окислительный стресс вызывает обширные повреждения, которые ставят под угрозу функциональность митохондрий и тем самым еще больше повышают уровень активных форм кислорода. Эти явления сопровождаются утечкой сосудов сетчатки, повышением уровня воспалительных цитокинов и гибелью как нервных, так и сосудистых типов клеток в сетчатке. Потеря сосудистых клеток и, следовательно, функциональности обширной капиллярной сети сетчатки приводит к гипоксии, которая является мощным стимулом дляразличных реакций. Такие ответы включают повышенную экспрессию фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), который управляет как проницаемостью, так и ангиогенезом, кардинальные особенности прогрессирующих, угрожающих зрению стадий ДР - диабетического макулярного отека и пролиферативной диабетической ретинопатии6.
Некоторые особенности ДР позволяют предположить, что организм (как больные, так и экспериментальные животные) обладает врожденной способностью сопротивляться этому показанию. Пациенты переживают несколько десятилетий СД, прежде чем у них развивается угрожающая зрению ДР 8,9,10,11,12,13. В то время как у грызунов не развиваются прогрессирующие, угрожающие зрению стадии ДР14, начальная/легкая форма ДР, которая проявляется, развивается только через несколько недель или месяцев СД15,16. Кроме того, как у пациентов, так и у экспериментальных животных ДР прогрессирует, и дисфункция/повреждение сетчатки нарастает по мере увеличения продолжительности СД. Наконец, у некоторых пациентов с СД ДР никогда не развивается. В некоторых случаях это связано с тем, что такие люди не страдают диабетом достаточно долго, чтобы развилась ДР. В других случаях это происходит потому, что они проявляют чрезвычайную устойчивость к DR; как и в случае с участниками исследования Medalist, у которых не развивается ДР после 50 и более лет СД17. Несмотря на столь убедительные доводы в пользу существования защиты от DR и ее огромную трансляционную значимость, механизм, лежащий в основе защиты, не подвергался интенсивному исследованию.
Описанный в настоящем документе защитный тест был разработан для облегчения изучения причин задержки развития ДР с момента начала СД у мышей с сахарным диабетом. Основные этапы этого анализа, применяемого к мышам с СД и без СД, включают (1) нанесение субмаксимального смертельного удара по глазу (ex vivo или in vivo), (2) изоляцию сосудистой сети сетчатки, (3) окрашивание сосудистой сети TUNEL и DAPI, (4) фотографирование полученных изображений и количественную оценку процента дважды положительных видов TUNEL/DAPI.

<table><tbody><tr><td>10% нейтральный буферизованный формалин</td><td>Fischer Scientific</td><td>SF100-4</td><td>Fixation</td></tr><tr><td>24-луночные планшеты</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>игла 33 G</td><td>Гамильтон</td><td>индивидуальный</td><td></td></tr><tr><td>гидроксид аммония&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>221228-1L-PCA</td><td></td></tr><tr><td>C57/BL6/J мыши</td><td>Лаборатория Джексона</td><td>Jax #000664</td><td></td></tr><tr><td>Цитокиновый коктейль</td><td></td><td></td><td>состоял из соотношения 1:1:1 1 & микро; г/мл TNF-&alpha;, 1&micro; г/мл ИЛ-1 &бета; и 1500 U/&micro; LIFN- &gamma;</td></tr><tr><td>Препарирующий микроскоп</td><td></td><td></td><td>Любой микроскоп, который позволяет хорошо визуализировать сетчатку глаза, является адекватным.</td></tr><tr><td>Щипцы Dumont #3</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11231-30</td><td>Прямые кончики</td></tr><tr><td>Щипцы Dumont #5&nbsp;</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11253-25</td><td>Микрозатупленные наконечники</td></tr><tr><td>Удобные чашки для культивирования тканей</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>35 x 10 мм</td></tr><tr><td>Стеклянная переводная пипетка</td><td>Fischer Scientific</td><td>1367820A</td><td>Отломите тонкий конец пастеровской пипетки и установите ... сломанный» Завершите резиновой грушей.</td></tr><tr><td>Harris модифицированный гематоксилин&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>HHS32</td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH, Bethesda</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Набор для обнаружения гибели клеток in situ, флуоресцеин</td><td>милипора</td><td>11684795910</td><td>реакционная смесь TUNEL</td></tr><tr><td>Микрозащитные стекла</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>22 мм x 22 мм</td></tr><tr><td>Микронож&nbsp;</td><td>Sharpoint</td><td>72-1551</td><td></td></tr><tr><td>Микрошпатель</td><td>для тонких научных инструментов</td><td>10091-12</td><td></td></tr><tr><td>Монтажная кассета&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Любая прозрачная кассета, которая немного больше предметного стекла микроскопа</td></tr><tr><td>Периодическая кислота</td><td>Sigma</td><td>3951</td><td></td></tr><tr><td>Периодическая кислота</td><td></td><td></td><td>раствор 35 мМ периодическая кислота с 12 мМ ацетата натрия&nbsp; в H2O&nbsp;</td></tr><tr><td>Монтажная среда Permount&nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>SP15- 100</td><td></td></tr><tr><td>Prism 9</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prolog Gold антивыцветающий реагент с DAPI</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Рекомбинантный человеческий ИФН- и гамма;</td><td>Peprotec</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>Рекомбинантный человеческий IL-1 &beta;</td><td>Peprotec</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>Рекомбинантный человеческий TNF-&alpha;</td><td>Peprotec</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>База реагентов Schiff&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>3952016</td><td></td></tr><tr><td>Shaker Incubator (шейкер для пупка)</td><td>IBI Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>BBUAAUV1S</tr><tr><td>Ацетат натрия</td><td>Sigma</td><td>71196</td><td></td></tr><tr><td>Steritop стерильный вакуумный флакон Millipore</td><td></td><td>SCGPS05RE</td><td>Создать фильтрованную воду</td></tr><tr><td>Superfrost Plus обработанные микроскопические стекла&nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-550-15</td><td>использовать слайды из закрытой коробки</td></tr><tr><td>Трет-бутилгидропероксид (TBH)</td><td>Sigma</td><td>75-91-2</td><td></td></tr><tr><td>ТРИЗМА основа</td><td>Fischer Scientific</td><td>11-101-5522</td><td>сделать 100 мМ Трис, отрегулировать pH до 7,8 с помощью HCl)</td></tr><tr><td>Трипсин 1:250</td><td>Amresco</td><td>0458-50G</td><td></td></tr><tr><td>Two" щетки»</td><td></td><td></td><td>Изготовлен из одного черного волоса&nbsp; Приклеен к концу пластиковой трансферной пипеткой. Одна щетка со свободным концом. Другая щетка с петлей</td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors&nbsp;</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma</td><td>65351-M</td><td></td></tr><tr><td>YL раствор трипсина&nbsp;</td><td></td><td></td><td>3% трипсин в 0,1 М Трис (pH 7,8)</td></tr><tr><td>Флуоресцентный микроскоп Zeiss LSM 710 Микроскопия</td><td></td><td></td> <td>Zeiss</td></tr></tbody></table>

Анализ для выявления защиты сосудистой сети сетчатки от смерти от диабета у мышей

An Assay to Detect Protection of the Retinal Vasculature from Diabetes-Related Death in Mice

Диабетическая ретинопатия (ДР) является сложным и прогрессирующим заболеванием глаз, характеризующимся двумя различными фазами патогенеза. Первая фаза включает в себя потерю защиты от вызванного диабетом повреждения сетчатки, в то время как вторая фаза сосредоточена на накоплении этого повреждения. Традиционные анализы в первую очередь сосредоточены на оценке капиллярной дегенерации, которая указывает на тяжесть повреждения, в основном обращаясь ко второй фазе ДР. Тем не менее, они лишь косвенно дают представление о том, были ли нарушены защитные механизмы сосудистой сети сетчатки. Чтобы устранить это ограничение, был разработан новый подход для непосредственной оценки защитных механизмов сетчатки, в частности, ее устойчивости к вызванным диабетом повреждениям, таким как окислительный стресс и цитокины. Этот защитный анализ, хотя изначально был разработан для диабетической ретинопатии, имеет потенциал для более широкого применения как в физиологическом, так и в патологическом контексте. Таким образом, понимание патогенеза диабетической ретинопатии включает в себя распознавание двух фаз потери защиты и накопления повреждений, при этом этот инновационный защитный анализ предлагает ценный инструмент для исследований и потенциально распространяется на другие медицинские состояния.

Успешная изоляция сосудистой сети сетчатки приводит к плоскому креплению всей сети сосудов сетчатки мыши с сохранением архитектурной целостности (рис. 2J). При периодическом окрашивании кислотно-шиффовым гематоксилином (ПАШ) можно выделить два типа сосудистых клеток: эндотелиальные клетки (ЭК) и перициты (ПК) (рис. 6). Ядра эндотелиальных клеток удлиненные, слегка окрашены и полностью находятся в стенках сосудов. Ядра перицитов округлые, густо окрашены, выступают из стенок капилляров. В образцах, окрашенных PASH, также обнаружены бесклеточные капилляры, в которых отсутствуют ядра.
Подход к индуцированию смерти руководствовался следующим обоснованием. Было высказано предположение, что защита была ограниченной, т.е. могла быть подавлена очень сильным смертельным оскорблением. Следовательно, повреждения (как ишемия/окислительный стресс, так и цитокины18) были оптимизированы таким образом, чтобы они вызывали легко обнаруживаемое увеличение, но все же субмаксимальную степень смерти (рис. 3 и рис. 5).
Важно подчеркнуть, что присутствие TUNEL-положительных ядер зависело от специфического типа повреждения, используемого для запуска гибели клетки. Повреждение ишемией/окислительным стрессом привело к трамвайному паттерну апоптоза клеток, как показано на рисунке 3, в то время как цитокиновое повреждение привело к отчетливому и четко определенному паттерну, как показано на рисунке 5. Оба паттерна можно наблюдать в сосудах сетчатки у пациентов с ДР22, что позволяет предположить, что оба типа агентов индуцируют гибель клеток у людей. Более того, наблюдаемые морфологические различия позволяют оценить, была ли патология вызвана окислительным стрессом или цитокинами.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66123/66123fig01.jpg"> Рисунок 1: Инструменты для изоляции сосудистой сети сетчатки мыши. Слева направо: монтажная кассета, две одноволосые щетки, перевернутая пипетка, микрошпатель, два изогнутых щипца, пружинные ножницы, микронож и щипцы с прямыми кончиками. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66123/66123fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66123/66123fig02.jpg"> Рисунок 2: Схема, показывающая основные этапы нанесения смертельного удара и последующей изоляции сосудистой сети сетчатки от мышиного глаза. (А) Индукция ишемии/окислительного повреждения, ex vivo. После энуклеации глазное яблоко подвергается ишемии при наличии ТБК. (Б) Введение цитокинов in vivo (интравитреальная инъекция). (C) Разрезание глазного яблока на две половины. (D) Ферментативное пищеварение сетчатки: удаление склеры и промывание сетчатки в воде двойной дистилляции на ночь. Инкубируют в растворе YL трипсина при 37 °С в течение 4 ч 15 мин в лунке 24-луночного планшета. (E) Удаление фоторецепторов. (F) Удаление оставшейся нервной и глиальной ткани. (G) Очищенная чашеобразная сосудистая сеть, обращенная вверх. (H) Изолированная сосудистая сетка в 35-миллиметровой чашке на черном фоне на предметном столике препарирующего микроскопа. (I) Сосудистая сеть сетчатки с плоским расположением на предметном стекле. (J) Высушенная на воздухе сосудистая сеть сетчатки на предметном стекле. Эта цифра была изменена по сравнению с Li et al.18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66123/66123fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66123/66123fig03v2.jpg"> Рисунок 3: Обнаружение апоптотических тел в сосудах сетчатки мыши, обработанных ex vivo с ишемией +/- TBH. Репрезентативные изображения апоптотических тел, индуцированных ишемией +/- ox-стрессом в изолированных сосудах сетчатки. Заголовок каждого столбца указывает на окрашивание. (А-С) Сосуды сетчатки, выделенные из глазных яблок, подвергшихся только ишемии в течение 1 ч. (Д-Ж) То же, что и (А-С), за исключением того, что в течение 1 ч инсульт представлял собой комбинацию ишемии и окислительного стресса (5 мМ ТЧ). Красные стрелки указывают на репрезентативные двойные положительные виды TUNEL/DAPI. (Г-И) Положительный контроль, обработанный ДНКазой. Масштабная линейка = 50 мкм. Эта цифра была изменена по сравнению с Li et al.18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66123/66123fig03largev2.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66123/66123fig04.jpg"> Рисунок 4: Иллюстрация выбора поля для количественной оценки результатов. Сканирование сосудистой сети сетчатки размером 5 x 5 с объединением сигналов TUNEL и DAPI. Выделение шести-восьми полей на дальней периферии, окружающей зрительный нерв, показано красными квадратами. Увеличение, 200х. Масштабная линейка = 100 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66123/66123fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66123/66123fig05.jpg"> Рисунок 5: Обнаружение апоптотических тел в сосудах сетчатки мыши в ответ на интравитреальное введение цитокинов (введение in vivo). Репрезентативные изображения цитокин-индуцированных апоптотических тел в изолированных сосудах сетчатки. Заголовок каждого столбца указывает на окрашивание. (А-С) Изображения сосудов сетчатки, выделенных у мышей, интравитреально введенных PBS. (Д-Ж) То же, что и (А-С), за исключением того, что вместе с PBS вводили коктейль цитокинов. Красные стрелки указывают на репрезентативные TUNEL-положительные виды. Масштабные линейки = 100 мкм. Эта цифра была изменена по сравнению с Li et al.18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66123/66123fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66123/66123fig06.jpg"> Рисунок 6: Репрезентативное изображение сосудов сетчатки, окрашенных PASH. Сосуды сетчатки мыши, перенесшей 20 недель СД, индуцированного STZ, выделяли, как описано на рисунке 2, окрашивали PASH и визуализировали при освещении видимым светом. Ядра перицитов в капиллярах, как правило, более круглые и густо окрашенные (синие стрелки), в то время как удлиненные и менее плотно окрашенные ядра являются диагностическими для эндотелиальных клеток (красные стрелки). Желтая стрелка указывает на бесклеточный капилляр. Масштабная линейка = 50 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66123/66123fig06large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Был разработан защитный тест для мониторинга устойчивости сосудов сетчатки к смерти от инсультов, связанных с диабетом/диабетической ретинопатией, таких как окислительный стресс и цитокины.

Diabetic retinopathy (DR) is a complex and progressive ocular disease characterized by two distinct phases in its pathogenesis. The first phase involves ...

Наша цель состоит в том, чтобы понять причину постепенного начала диабетической ретинопатии, которая возникает спустя десятилетия после начала диабета. Мы исследуем патогенез диабетической ретинопатии в два этапа: потеря защиты и накопление повреждений. Наша цель состоит в том, чтобы исследовать защиту сосудов сетчатки от поражений, вызванных диабетом, с помощью защитного анализа.Наш защитный анализ выявляет две фазы потери защиты и накопления повреждений, связанных с диабетической ретинопатией. Таким образом, этот инновационный подход является ценным инструментом для понимания патогенеза диабетической ретинопатии. И потенциальное применение может быть расширено за пределы DR, оно может быть применено к более широкому физиологическому и патологическому контексту.В то время как существующая литература преимущественно сосредоточена на патологических изменениях при диабетической ретинопатии, остается заметный пробел в наших знаниях о защитных факторах. Этот защитный анализ играет решающую роль в преодолении дефицита и помогает нам понять роль защитных факторов, участвующих в устойчивости сосудистой сети сетчатки к повреждениям, вызванным диабетом. Этот новый защитный анализ расширяет наше понимание прогрессирования диабетической ретинопатии, предоставляя целевой инструмент для изучения задержки между началом диабета и проявлением ДР у мышей.Он продвигает наши исследования, анализируя взаимодействие между защитой и повреждением, предлагая потенциал для таргетной терапии и более широкого применения. Наши будущие исследования будут сосредоточены на определении конкретных типов клеток, эндотелиальных клеток, паразитов и нейронных клеток в сетчатке мыши, а также молекулярных механизмов, лежащих в основе этой защиты. Кроме того, мы стремимся идентифицировать потенциальные гены, лежащие в основе этого защитного механизма.

an-assay-to-detect-protection-retinal-vasculature-from-diabetes

Research

JoVE Journal

Medicine

Медицина

Трипсин дайджеста является одним из наиболее широко используемых методов анализа ретинальных сосудов. Эта рукопись описывает способ, в деталях, в том числе ключевых изменений для оптимизации техники и удалить не-сосудистой ткани, сохраняя при этом общую архитектуру сосудов.

Трипсин Digest протокола для анализа сосудистой сети сетчатки модели мыши

Недорогой, простой в использовании и мощная система создана для оценки потенциальных методов лечения, которые могли бы улучшить барьерную сетчатки крови нарушение, вызванное гистамином. Утечка кровеносного сосуда, активация клеток Мюллера и непрерывность нейронных процессов используются для оценки реакции ущерба и его разворот с потенциальным препаратом, lipoxin А4.

Острый сетчатке Модель для оценки крови сетчатке Барьерные нарушения и потенциальных лекарственных препаратов для лечения

Многие видение угрожая глазные заболевания связаны с неблагополучной сетчатки микрососудов. Таким образом измерение артериолы сетчатки ответов имеет важное значение для расследования основные патофизиологические механизмы. Эта статья описывает подробный протокол для мыши артериолы сетчатки изоляции и подготовке для оценки воздействия вазоактивных веществ на сосудистой диаметра.

Шаги подготовки для измерения реактивности в мыши артериол сетчатки Ex Vivo

Нейронная дегенерация в обоих глазах и головном мозге в результате диабета может наблюдаться с помощью поведенческих тестов, проводимых на грызунах. Y-лабиринт, мера пространственного познания, и оптомоторный ответ, мера зрительной функции, дают представление о потенциальных диагнозах и методах лечения.

Поведенческая оценка зрительной функции с помощью оптомоторного ответа и когнитивной функции через Y-лабиринт у крыс с диабетом

Протокол описывает органотипические экспланты мышечной нейро сетчатки,культивируемые вместе с эпителием пигмента сетчатки (RPE), в R16 определяется среда, без сыворотки и антибиотиков. Этот метод относительно прост в работе, дешевле и оторится по сравнению с экспериментами in vivo и может быть адаптирован к многочисленным экспериментальным приложениям.

Долгосрочное, без сыворотки культивирование органотипических мышь Сетчатки Explants с Intact сетчатки Пигмент Эпителий

Этот протокол описывает подробный метод приготовления и иммунофлуоресцентного окрашивания мышей с плоскими креплениями и анализа. Также подробно описано использование флуоресцеиновой ангиографии глазного дна (FFA) для детенышей мышей и обработка изображений.

Мониторинг динамического роста сосудов сетчатки в мышиной модели инсулин-индуцированной ретинопатии

Диабетическая ретинопатия является одной из ведущих причин слепоты. Гистология, анализ разрушения барьера сетчатки крови и флуоресцентная ангиография являются ценными методами для понимания патофизиологии сетчатки, что может еще больше повысить эффективность скрининга лекарств против диабетической ретинопатии.

Патофизиологическая оценка сетчатки в модели крысы

В данной статье описан хорошо зарекомендовавший себя и воспроизводимый анализ лектиновых пятен для всего препарата сетчатки и протоколы, необходимые для количественного измерения сосудистых параметров, часто изменяющихся при пролиферативных и непролиферативных ретинопатиях.

Количественная оценка сосудистых параметров у целых сетчаток мышей с непролиферативными и пролиферативными ретинопатиями

В данной рукописи представлен протокол гистологической подготовки предметных стекол из глазных яблок грызунов. С помощью предложенного метода внутреннюю часть сетчатки можно легко визуализировать и оценить под световым микроскопом. Процедура представлена для глазных яблок мышей и крыс.

Подготовка и анализ гистологических стекол глазных яблок крыс и мышей для оценки сетчатки глаза

Этот протокол моделирует ишемию-реперфузионное повреждение сетчатки в глазу мыши путем индуцирования ишемии сетчатки через канюляцию передней камеры и повышения внутриглазного давления с последующей нормализацией внутриглазного давления для инициирования реперфузии.

Индукция ишемии-реперфузионного повреждения сетчатки на модели глаза мыши

Мы демонстрируем метод маркировки стенок сосудистой сети сетчатки и адгезивных лейкоцитов. Эти адгезивные лейкоциты затем могут быть подсчитаны под флуоресцентным микроскопом как параметр воспаления или реакции этого воспаления на терапию.

Количественная оценка индуцированных сахарным диабетом адгезивных лейкоцитов в сосудистой сети сетчатки

Изучите защиту сосудистой сети сетчатки от диабетического повреждения у мышей с помощью нового анализа защиты. Этот метод помогает исследовать механизмы устойчивости сосудов к диабетической ретинопатии.

Анализ для выявления защиты сосудистой сети сетчатки от смерти от диабета у мышей

Больше видео