Вычислительное прогнозирование аминокислотных предпочтений потенциально мультиспецифических пептид-связывающих доменов, участвующих в белок-белковых взаимодействиях

Мы предлагаем протокол для вычислительного прогнозирования предпочтений аминокислот в более специфических белок-белковых взаимодействиях. Этот протокол можно рассматривать как первый шаг в разработке медиаторов этих взаимодействий. Мы заинтересованы в использовании этих медиаторов в качестве потенциальных ингибиторов специфических взаимодействий, в иммунологической технологии.

Наш разработчик, используемый для характеристики аминокислотных предпочтений среди конкретных сайтов связывания, является дорогостоящим и громоздким. Наш протокол представляет собой биологическую технологию, основанную на эффективности и серийных операциях. Эта стратегия обладает потенциалом для обработки большого числа линейных последовательностей, обеспечивая полное и последовательное различие предпочтений аминокислот.

Наш протокол предлагает профессиональную и экономичную обработку большого количества последовательностей ДНК, предпочтительных по сравнению с более полными из обычно ограниченного числа последовательностей, процессами в веб-лабораториях. В дополнение к разработке ингибиторов иммунологических продуктов, мы хотели бы сравнить эффективность этой методологии с другими семействами продуктов. Это позволит нам лучше понять структурную основу мультиспецифичности не только в иммунологическом контексте, но и в других клеточных функциях, таких как передача сигналов и коммуникация.

Начните с загрузки структуры белково-белкового комплекса. Для этого перейдите на домашнюю страницу банка данных белков и введите идентификатор PDB в главное поле поиска. На главной странице структуры нажмите «Загрузить файлы», а затем «Биологическая сборка 1», чтобы загрузить файлы в формате PDB gz.

Откройте скачанную структуру в UCSF Chimera. Перейдите в раздел «Инструменты», затем «Редактирование структуры» и нажмите «Изменить идентификаторы цепочки». Переименуйте вторую цепочку, первоначально помеченную как A, в B. Затем нажмите «Избранное», а затем «Панель моделей».

Выберите модель с двумя цепочками и нажмите кнопку «Группировать/разгруппировать», чтобы разделить каждую цепочку в отдельную модель. Далее выберите две модели и нажмите на кнопку копирования/объединения. Введите новое имя для объединенной модели.

Установите флажок Закрыть исходные модели и нажмите OK. Нажмите «Выбрать», затем «Цепочка» и подтвердите, что цепочки в димере теперь идентифицируются как A и B. Нажмите на «Файл» и сохраните PDB, чтобы сохранить отредактированную структуру как новый файл PDB. Для идентификации целевого сегмента в белке лиганда перейдите на сервер BUDE Alanine Scan. Нажмите кнопку «Выбрать файл» в разделе «Загрузка структуры» и загрузите сохраненный PDB-файл.

На следующей странице убедитесь, что структура была загружена правильно, и введите имя задания на сервере. Установите цепи A в качестве рецептора, а B в качестве лиганда, и нажмите кнопку Start Scan, чтобы отправить задание. После завершения работы нажмите «Показать результаты», чтобы открыть страницу «Результаты».

В списке Остаток выберите участок остатков, который будет лучше взаимодействовать с целевой поверхностью связывания. С использованием этого протокола был предсказан и сегмент аминокислоты, взаимодействующий с поверхностью связывания IRF5. С помощью компьютерного сканирования мутагенеза аланина был предсказан сегмент из 13 аминокислот из положений 424 по 436, при этом мотив p L x IS начинался с аргинина 432.

Для начала подготовьте интерфейс белкового пептида для диверсификации последовательностей. Откройте PDB-файл в Chimera и убедитесь, что структура целевых субъединиц не повреждена и не содержит отсутствующих атомов или связей. Чтобы удалить все заменимые молекулы из структуры, нажмите на Выбрать, затем на Остатки, а затем выбрать все молекулы, кроме стандартных аминокислот.

Затем нажмите на Действия, а затем на Адамс/Бондс и удалите. Затем нажмите на «Избранное» в разделе «Последовательность», а затем нажмите на цепочку, которая считается лигандом. Обрезайте цепь лиганда до идентифицированного взаимодействующего сегмента, удалив все остатки, кроме тех, которые находятся между выбранными позициями.

Нажмите «Файл» и сохраните PDB, чтобы сохранить отредактированную структуру в другом PDB-файле. Скопируйте этот файл в папку Linux, доступную для приложений Rosetta. Используйте приложение fixedbb от Rosetta для выполнения переупаковки всех боковых цепей аминокислот базовой структуры перед диверсификацией последовательности, выполнив эту команду.

Затем переименуйте файл repack PDB с суффиксом _repack с помощью следующей команды. Затем запустите pepspec в режиме проектирования, чтобы выполнить диверсификацию последовательностей с помощью этой команды. Затем сгенерируйте шим с помощью gen pepspec pwm.

py, входящий в состав люкса Rosetta. Чтобы запустить этот скрипт, используйте следующую команду. Чтобы создать логотип последовательности, откройте файл с пептидными последовательностями, сгенерированными на предыдущем шаге, в предпочитаемом текстовом редакторе и скопируйте все последовательности.

Перейдите на сервер WebLogo и вставьте последовательности в текстовое поле Множественное выравнивание последовательностей. Выберите желаемый формат и размер логотипа в соответствии с длиной ввода и нажмите «Создать логотип». Используя этот протокол, были предсказаны предпочтения аминокислот для консервативного мотива p L x IS на поверхности связывания IRF5.

Положение, весовая матрица и логотип последовательности, полученные при диверсификации последовательностей, показали предпочтение глутамату в положении 432, а также лейцину и изолейцину в положениях 433 и 435. Позиции 427, 429 и 436, обычно занимаемые серином, показали более высокое предпочтение аспартата и глутамата, подчеркивая роль фосфорилирования и димеризации IRF5. Позиция 425 показала высокое предпочтение серину, предполагая его участие в белок-белковом взаимодействии в его нефосфорилированной форме.