Рабочий процесс количественной оценки эндофитных и эпифитных бактериальных микробиомов коры Populus trichocarpa

[Ведущий] Рабочий процесс количественной оценки эндофитных и эпитетических бактериальных микробиомов коры Populus trichocarpa. В этой статье мы разработали и протестировали подробный рабочий процесс для изучения микробиома, колонизирующего внутренние ткани или поверхности коры Populus trichocarpa. В этом рабочем процессе подробно описывается отбор проб эндофитных и эпитетических микробиомов коры Populus trichocarpa, обработка собранных материалов, экстракция геномной ДНК, ПЦР-амплификация целевых областей, подготовка библиотек ДНК и секвенирование эндофитных и эпитетических бактериальных микробиомов с помощью технологии секвенирования нового поколения. Мы также предоставляем краткую аналитическую процедуру для полученных данных секвенирования. Этот проверенный рабочий процесс обеспечит эффективный подход к эмпирическому исследованию эндофитных и эпитетических микробиомных сообществ коры Populus trichocarpa и других лесных пород. Вырастите трехмесячные саженцы Populus trichocarpa в ростовой камере, срезайте 10-сантиметровые сегменты стебля Populus trichocarpa от двух до 12 сантиметров над стерилизованной поверхностью почвы с помощью стерилизованного секатора. Поместите сегменты стебля в стерилизованную квадратную чашку Петри. Многократно протрите эпидермис стебля на стерилизованной квадратной чашке Петри, используя стерильную вату с 0,1%. Подросток 20. Храните каждый кусочек ваты, содержащий микроорганизмы, эпитетические образцы в стерильной центрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитра при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Протерев поверхность стебля, разрежьте кору стерильным скальпелем, снимите кору и поместите ее в квадратную чашку Петри. Стерильным скальпелем разрежьте содранную со стебля кору примерно на один сантиметровый сегмент. Стерилизуйте поверхности сегментов, замочив их в 70% спирте в течение двух минут, а затем замочите сегменты в гипохлорите натрия с содержанием 0,1%, Tween 80 на пять минут. Наконец, простерилизуйте сегменты в 70% спирте в течение 30 секунд. Затем трижды промойте все образцы стерильной дистиллированной водой и поместите их на чистую скамейку для сушки на воздухе. Храните каждый стерилизованный эндофитный образец коры стебля в стерильной двухмиллилитровой центрифужной пробирке при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Поместите секции коры стебля в стерильные твердые пробирки объемом пять миллилитров и добавьте в каждую трубку по три стерилизованных стальных бусины. Заморозьте твердые пробирки с образцами в жидком азоте на 10 минут. Измельчите образцы коры в течение пяти минут с помощью бисерной молотки. Затем снова заморозьте жесткую трубку в жидком азоте на одну минуту и повторяйте этап взбивания бусин в течение пяти минут. Добавьте измельченную кору стебля Populus trichocarpa и прилипшие эпитетические бактериальные сообщества хлопка, по 0,25 грамма каждое, к каждой из трубок с шариками, а затем добавьте 60 микролитров раствора C1, поставляемого в коммерческом наборе, и аккуратно перемешайте путем инверсии. Затем гомогенизируйте эндофитные и эпитетические образцы с помощью бисерной машины в четыре прохода по одной минуте. После каждого прогона помещайте образцы на лед на 30 секунд. Центрифугируйте пробирки при 10 000-кратном течении силы тяжести в течение одной минуты, извлеките эндофитные и эпитетические образцы с помощью набора, следуя инструкциям производителя, добавьте 30 микролитров раствора C6 в центр белой фильтрующей мембраны и инкубируйте при температуре 25 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Центрифугируйте при 10 000-кратном давлении при комнатной температуре в течение одной минуты. Измерьте концентрации геномной ДНК, выделенной из эпитетических и эндофитных образцов, с помощью микрообъемного спектрофотометра. Разбавьте каждый образец ДНК стерильным ddH2O до двух нанограммов на микролитр, чтобы получить матрицу ДНК для ПЦР-амплификации. Амплифицируйте участки от V5 до V7 бактериального гена 16S рРНК с помощью прямого праймера 799F и обратного праймера 1193R. Между тем, амплифицируйте V4-область бактериального гена 16S рРНК с помощью прямого праймера 5115F и обратного праймера 806R. Тщательно перемешайте каждый образец и центрифугируйте для удаления пузырьков. Выполните амплификацию области от V5 до V7 или V4 бактериальных генов 16S рРНК на термическом амплификаторе. Загрузите по пять микролитров каждого образца ампликона на 1% агарозный гель и проведите электрофорез при напряжении 120 вольт в течение 30 минут. Просмотрите гель под ультрафиолетовым светом, чтобы подтвердить успешную амплификацию ПЦР. Для каждого образца смешайте три реплики продуктов амплификации ПЦР в пробирке для ПЦР. Определяйте концентрацию амплифицированных продуктов с помощью коммерческого набора в соответствии с инструкцией производителя. Измерьте флуоресценцию с помощью считывателя микропланшетов. Постройте стандартную кривую ДНК и используйте ее для расчета концентраций ДНК в амплифицированных продуктах. В зависимости от их измеренной концентрации смешать полученные продукты ПЦР эндофитных или эпифитных образцов из коры Populus trichocarpa в равной концентрации для построения библиотеки Ампликона. Проводят электрофорез в агарозном геле с помощью аппарата для электрофореза. Кратко приготовьте 1,3% агарозный гель, 1,3 грамма порошка агарозы в 100 миллилитрах однократного буфера TAE. Снимите расчески после затвердевания геля и поместите гель в резервуар для электрофореза с одноразовым буфером TAE. Затем добавьте одну единицу объема шестикратного оранжевого загрузочного буфера к пяти объемным единицам каждого продукта ПЦР со 100 микролитрами лестницы, загруженной в каждую лунку. Добавьте 30 микролитров лестницы ДНК в одну лунку. После подключения положительного и отрицательного проводов проведите электрофорез 80 вольт в течение 50 минут. Вырежьте фрагменты ДНК из агарозного геля с помощью чистого острого скальпеля. Взвесьте гелевый ломтик и переложите его в бесцветную пробирку. Добавьте буфер для погружения в гелевый ломтик. Выполняйте экстракцию геля с помощью набора для экстракции геля, следуя инструкциям производителя. Определите концентрацию очищенной библиотеки Amplicon на флуориметре с помощью коммерческого набора, следуя протоколу производителя по профилированию секвенирования. Считывание стандартных и пробных пробирок с помощью флуориметра и подтверждение качества библиотеки путем визуализации одного канала. Анализируйте и аннотируйте последовательности генов 16S рРНК с помощью CHAM II. Создание таксономических аннотаций с помощью Серебряной базы данных в соответствии со ссылочными последовательностями. Визуализируйте эти результаты с помощью пакета ggplot2 в R. Получена высококачественная геномная ДНК эндофитных и эпитетических бактериальных микробиомов коры Populus trichocarpa. В результате ПЦР-амплификации всех 12 образцов были получены одиночные сильные полосы с правильным размером. Библиотека Amplicon была дополнительно построена с одним пиком, который удовлетворял требованиям предварительного секвенирования. Для эндофитных микробиомов были получены высококачественные показания с использованием пар праймеров 799F/1193R и 515F/806R соответственно. Пара праймеров 799F/1193R дала значительно меньше усиленных растительных прочтений. Количество ASV из эпитетического микробиома коры Populus trichocarpa было значительно выше при использовании праймеров 799F/1193R по сравнению с праймерами 515F/806R. Индекс Шеннона был оценен как более низкий в эпифитном бактериальном сообществе коры, чем в эндофитном бактериальном сообществе с использованием праймерной пары 799F/1193R. Таксономические характеристики бактериальных сообществ в эндофитных и эпифитных частях коры Populus trichocarpa были дополнительно изучены с использованием пары праймеров 799F/1193R. Был создан надежный и эффективный рабочий процесс от сбора образцов до анализа данных для количественной оценки состава и разнообразия эндофитных и эпитетических бактериальных микробиомов коры Populus trichocarpa. Наш протокол может послужить путем для изучения микробиома коры древесных видов растений, позволяя лучше понять особенности бактериальных сообществ, населяющих другие древесные растения.