Мониторинг циркадных колебаний с помощью биолюминесцентного репортера в органоидах
February 16th, 2024
Циркадные ритмы, существующие у большинства организмов, регулируют временную организацию биологических процессов. В последнее время 3D-органоиды стали физиологически актуальной моделью in vitro . Этот протокол описывает использование биолюминесцентных репортеров для наблюдения за циркадными ритмами в органоидах, что позволяет проводить исследования циркадных ритмов в многоклеточных системах in vitro .
В настоящее время наша сфера исследований заключается в изучении роли циркадных ритмов в пролиферации и дифференцировке эпителиальных клеток кишечника. Мы пытаемся определить, регулируют ли циркадные часы пролиферацию и дифференцировку клеток из кишечных стволовых клеток. Этот протокол представляет собой метод мониторинга циркадных исследований трехмерных органоидов в режиме реального времени с использованием биолюминесцентного анализа.
В отличие от проведения биолюминесцентных анализов в обычной двумерной клеточной культуре, этот подход позволяет нам исследовать циркадные ритмы и их функции в более физиологически релевантной органоидной модели. Наши результаты показывают нарушение циркадных ритмов в условиях, обогащенных стволовыми клетками, в то же время демонстрируя устойчивые циркадные колебания в дифференцированных кишечных органоидах человека, что предполагает ремоделирование механизма циркадных часов от стволовых клеток к дифференцированным клеткам. Использование полученных от пациента органоидов с циркадными биолюминесцентными репортерами поможет нам улучшить наше понимание циркадных ритмов в периферических органах и различных болезненных состояниях.
Обзор
В данном исследовании изучаются роли циркадных ритмов в пролиферации и дифференциации клеток интестинальной эпителия с использованием трехмерных органоидов. Протокол описывает метод биолюминесцентного анализа для мониторинга циркадных колебаний, выявляющий значительные различия в ритмичности в зависимости от состояния дифференциации клеток.
Ключевые компоненты исследования
Область исследования
- Циркадные ритмы
- Биология интестинального эпителия
- Пролиферация и дифференциация клеток
Бакграунд
- Циркадные ритмы регулируют различные биологические процессы в многоклеточных организмах.
- Органоид представляет более физиологически релевантную модель по сравнению с традиционными 2D культурами.
- Понимание циркадной регулировки в стволовых клетках по сравнению с дифференцированными клетками является важным для развивающейся биологии.
Использованные методы
- Биолюминесцентный анализ для реального мониторинга циркадных ритмов
- Человеческие интестинальные энтероиды (HIEs) в качестве биологической модели
- Использование органоидов, полученных от пациентов, с циркадными биолюминесцентными репортерами
Основные результаты
- Были замечены устойчивые циркадные колебания в дифференцированных человеческих интестинальных энтероидах.
- В условиях, обогащенных стволовыми клетками, были обнаружены нарушенные циркадные ритмы.
- Анализ быстрого преобразования Фурье подтвердил среднюю периодичность 22,92 часа в условиях дифференциации.
Выводы
- Исследование демонстрирует дифференциальную регулировку циркадных ритмов в процессе интестинальной дифференциации.
- Полученные знания могут продвинуть понимание циркадной биологии в состояниях заболевания.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Real-time bioluminescence monitoring of circadian oscillations in human intestinal organoids enables discovery teams to interrogate temporal regulation of cell proliferation and differentiation in a physiologically relevant 3D system. This approach advances predictive confidence in target validation for pathways influenced by circadian biology, supporting risk-adjusted decisions at early discovery and preclinical inflection points. Integration of patient-derived organoids further enhances translational continuity for disease-relevant research portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic interrogation of circadian regulation in stem cell proliferation and differentiation.
- Supports biological de-risking by modeling multicellular interactions absent in 2D cultures.
- Improves predictive confidence for targets modulated by temporal cellular processes.
Screening & Assay Development
- Establishes validated 3D organoid systems for quantitative circadian readouts.
- Facilitates assay reproducibility and standardization through real-time bioluminescence measurement.
- Prepares robust platforms for compound evaluation in disease-relevant contexts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with in vivo physiology using patient-derived organoids.
- Enables investigation of circadian disruption in disease models for translational biomarker discovery.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in peripheral organ systems.
Pipeline & Workflow Integration
This bioluminescence-based circadian monitoring method bridges early discovery, target validation, and preclinical research by providing quantitative, physiologically relevant data in 3D organoid models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on circadian regulation of cell fate decisions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative circadian outputs for assay development.
- Analytics: Provides time-series bioluminescence data and fast Fourier transform analysis for robust comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Enables disease-relevant modeling using patient-derived organoids.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, reusable platform for diverse circadian and differentiation studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in circadian pathway studies.
- Operational Value: Standardizes real-time monitoring and enhances reproducibility in complex 3D systems.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and improves capital efficiency by de-risking early-stage targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of programs involving temporal regulation or disease-relevant circadian disruption.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D organoid culture and bioluminescence assay setup.
- Needs access to incubating luminometers and analytical software for time-series data analysis.
- Demands cross-team standardization for reproducible circadian measurements.
- May require adaptation for different organoid types or disease models.
- Dependent on robust synchronization and differentiation protocols for consistent outputs.
