Биолюминесцентный резонансный перенос энергии (BRET) для измерения взаимодействий CRAF с белками 14-3-3 в живых клетках
1 марта 2024 г.
Этот протокол описывает анализ на основе БРЭТ для измерения взаимодействий киназы CRAF с белками 14-3-3 в живых клетках. В протоколе изложены шаги по подготовке ячеек, считыванию излучений BRET и анализу данных. Также представлен пример результата с идентификацией соответствующих элементов управления и устранением неполадок для оптимизации анализа.
Основное внимание в наших исследованиях уделяется выявлению новых уязвимостей в пути киназы Ras-MAPK путем изучения мутаций, связанных с редкими заболеваниями внутри. Недавно мы разработали еще один анализ на основе BRET для измерения аутоингибиторной активности киназ RAF в живых клетках. Важно отметить, что этот анализ был необходим для характеристики группы редких мутаций зародышевой линии в домене, богатом цистеином BRAF, что продемонстрировало критическую важность этого домена для поддержания аутоингибирования BRAF и предотвращения конститутивной биологической активности BRAF.
Этот анализ измеряет взаимодействие 1433 белков с RAF-киназой CRAF, и эти взаимодействия играют важную роль в опосредовании функции RAF как в развитии, так и в заболевании. Кроме того, этот анализ в сочетании с ранее разработанными методами измерения аутоингибирования RAF и взаимодействия RAF-RAF составляют основу инструментария для анализа регуляторных механизмов киназ RAF в живых клетках.
Обзор
В данном протоколе описывается анализ на основе BRET для измерения взаимодействий киназы CRAF с белками 14-3-3 в живых клетках. Этот анализ имеет решающее значение для понимания регуляторных механизмов киназ RAF как при развитии, так и при заболеваниях.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Биохимия
- Передача сигнала
Теоретическая часть
- Путь RAS-MAP-киназы имеет жизненно важное значение для различных клеточных процессов.
- RAF-киназы, включая B-RAF и C-RAF, являются ключевыми регуляторами этого пути.
- Белки 14-3-3 взаимодействуют с RAF-киназами, влияя на их функцию.
- Понимание этих взаимодействий может дать представление о мутациях при редких заболеваниях.
Цель исследования
- Для измерения взаимодействий CRAF с белками 14-3-3.
- Для характеристики роли специфических мутаций в киназах RAF.
- Для разработки набора инструментов для изучения регуляции RAF в живых клетках.
Используемые методы
- Подготовка клеток 293 FT для проведения BRET-анализа.
- Измерение BRET-излучения для оценки белковых взаимодействий.
- Анализ данных для оптимизации анализа и идентификации контролей.
- Использование ранее установленных методов анализа для комплексного исследования.
Основные результаты
- Успешное измерение взаимодействий белков CRAF и 14-3-3.
- Идентификация критических доменов в киназах RAF, ответственных за автоингибирование.
- Демонстрация применимости данного анализа для изучения редких мутаций.
- Создание основы для будущих исследований, связанных с RAF.
Выводы
- Метод анализа на основе BRET эффективен для изучения взаимодействий киназ RAF.
- Полученные данные могут лечь в основу терапевтических стратегий лечения соответствующих заболеваний.
- Данная работа способствует пониманию механизмов регуляции киназ RAF.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Количественное измерение взаимодействий белков CRAF и 14-3-3 в живых клетках решает критическую задачу валидации мишеней при поиске лекарственных средств, воздействующих на путь RAS-MAPK. Данный анализ на основе BRET позволяет снизить механистические риски путем прямого изучения регуляторных белок-белковых взаимодействий, участвующих в онкогенной сигнализации и развитии редких заболеваний. Этот подход обеспечивает прогностическую уверенность на раннем этапе поиска и сортировки мишеней для дальнейшего развития портфеля разработок.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Раннее обнаружение и валидация мишени
- Позволяет напрямую исследовать взаимодействия CRAF-14-3-3, которые играют центральную роль в регуляции пути RAS.
- Обеспечивает функциональную валидацию значимых для заболевания мутаций, влияющих на активность киназы RAF.
- Способствует снижению механистических рисков путем количественной оценки влияния специфических мутаций на связывание белков.
- Создает условия в живых клетках для оценки взаимодействий регуляторных белков, имеющих значение для биологии заболевания.
Скрининг и разработка анализа
- Предоставляет валидированную платформу для количественного анализа белок-белковых взаимодействий в живых клетках.
- Обеспечивает воспроизводимое обнаружение нарушения взаимодействия вследствие сайт-специфических мутаций.
- Поддерживает стандартизацию и масштабируемость анализа для скрининга соединений, нацеленных на интерфейсы RAF-14-3-3.
- Позволяет получать надежные количественные данные, подходящие для последующих этапов рабочих процессов скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует системам, релевантным для заболеваний, за счет моделирования взаимодействий, имеющих значение при раке и RAS-патиях.
- Обеспечивает непрерывный переход от выявления механизмов к доклинической валидации модуляции сигнальных путей.
- Позволяет принимать обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем продвижении на основе количественных данных о взаимодействиях.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Этот анализ на основе BRET интегрируется в процесс разработки лекарств — от ранней валидации мишени до идентификации соединений-лидеров и доклинических исследований, обеспечивая поддержку как механистических исследований, так и скрининговых кампаний.
- Биология открытий: Количественная оценка взаимодействий регуляторных белков для выяснения механизмов сигнальных путей и проверки терапевтических гипотез.
- Скрининг: Обеспечение готовности и воспроизводимости анализа для оценки модуляторов связывания CRAF-14-3-3.
- Аналитика: Получение количественных показателей BRET и данных, зависящих от мутаций, для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: Моделирование значимых для заболевания белковых взаимодействий для обеспечения непрерывности доклинических исследований.
- Корпоративное повторное использование: Создание универсального набора инструментов для изучения регуляции RAF-киназы в системах живых клеток.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней.
- Операционная ценность: стандартизирует анализы взаимодействия живых клеток для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: служит основой для принятия решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет снижения рисков на ранних этапах выбора мишеней.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение программ по пути RAS.
Рекомендации по реализации
- Требуется опыт в разработке анализов на живых клетках и анализе белковых взаимодействий.
- Необходим доступ к многофункциональным планшетным ридерам и инфраструктуре для количественного детектирования BRET.
- Требуется межкомандная стандартизация настройки анализа, анализа данных и валидации экспрессии белков.
- В зависимости от целей исследования может потребоваться адаптация для различных клеточных линий или изоформ RAF.
- Чувствительность и специфичность анализа зависят от дизайна конструктов и выбора мутаций, как показано в протоколе.
