Динамика цАМФ в реальном времени в живых клетках с использованием флуоресцентного дифференциального детектора цАМФ in situ
22 марта 2024 г.
Протокол, представленный в этом исследовании, иллюстрирует эффективность дифференциального детектора цАМФ in situ в измерении цАМФ с помощью двух методов. В одном из методов используется 96-луночный планшетный спектрофотометр с ячейками HEK-293. Другой метод демонстрирует отдельные клетки HASM под флуоресцентным микроскопом.
Мы обслуживаем организацию циклических микродоменов КП, уделяя особое внимание выяснению того, как эти компартменты формируются и поддерживаются. Мы стремимся раскрыть ключевые компоненты, которые позволяют клеткам различать пространственные сигналы в этих доменах, исследуя вариации в их интерпретации, а также то, как эти особенности изменяются при таких заболеваниях, как астма и ХОБЛ. Инфицирование первичных клеток с помощью вектора Бекмана является сложной задачей.
Для этого состояние должно быть оптимизировано для каждого типа клеток, чтобы добиться достаточной экспрессии биосенсора. Этот протокол позволяет обнаруживать и контролировать в режиме реального времени, от нескольких минут до нескольких часов, а также измерять динамику циклокампуса в живых клетках. Этот биосенсор обладает высокой специфичностью для соблюдения циклического лагеря P. Следовательно, сигналы, генерируемые в этом эссе, напрямую коррелируют с циклическими уровнями P, значительно снижая потенциальные помехи от других клеточных компонентов и обеспечивая надежные результаты.
Обзор
В данном исследовании представлен протокол измерения уровней cAMP с помощью системы cAMP Difference Detector In Situ. Рассматриваются два метода: один с использованием спектрофотометра для 96-луночных планшетов и клеток HEK-293, другой — с использованием отдельных клеток HASM под флуоресцентным микроскопом.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Передача сигнала
Теоретические основы
- Понимание динамики цАМФ имеет решающее значение для выяснения механизмов клеточной сигнализации.
- Исследование сосредоточено на том, как клетки интерпретируют пространственные сигналы внутри микродоменов.
- Нарушения этих процессов связаны с такими заболеваниями, как астма и ХОБЛ.
- Существуют определенные трудности в оптимизации условий для инфицирования первичных клеток.
Цель исследования
- Разработать надежный метод детекции уровней цАМФ в режиме реального времени.
- Изучить динамику цАМФ в живых клетках.
- Снизить влияние других клеточных компонентов на результаты измерений.
Используемые методы
- Использование спектрофотометра для считывания 96-луночных планшетов.
- Флуоресцентная микроскопия для анализа отдельных клеток.
- Применение высокоспецифичного биосенсора цАМФ.
- Мониторинг динамики цАМФ в режиме реального времени на протяжении от нескольких минут до нескольких часов.
Основные результаты
- Биосенсор cAMP обеспечивает достоверные результаты, коррелирующие с уровнями циклического АМФ.
- Высокая специфичность сводит к минимуму воздействие других клеточных компонентов.
- Были разработаны эффективные методы измерения как для клеток HEK-293, так и для клеток HASM.
- Получены данные о механизмах пространственной сигнализации внутри клеток.
Выводы
- Данный протокол углубляет понимание сигналинга цАМФ в различных типах клеток.
- Он создает основу для будущих исследований клеточных ответов при различных заболеваниях.
- Методы могут быть адаптированы для различных экспериментальных условий и типов клеток.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Количественное определение динамики cAMP в живых клетках в режиме реального времени имеет решающее значение для снижения рисков на ранних этапах поиска новых лекарств и валидации мишеней сигналинга в системах, релевантных конкретным заболеваниям. Биосенсор cADDis позволяет проводить непрерывное количественное измерение cAMP как в иммортализованных, так и в первичных клетках, что повышает прогностическую достоверность при исследовании сигнальных путей. Эта возможность оптимизирует отбор перспективных направлений разработки за счет предоставления надежных и воспроизводимых данных о событиях внутриклеточного сигналинга, имеющих значение для моделей респираторных и других заболеваний.
Стратегические области применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую исследовать пути передачи сигналов цАМФ в живых клетках, имеющих значение для изучения заболеваний.
- Способствует снижению механистических рисков за счет обеспечения количественных показателей активации путей в режиме реального времени.
- Облегчает функциональную валидацию мишеней посредством динамического мониторинга клеточных ответов на фармакологические агенты.
- Повышает прогностическую уверенность при продвижении мишеней с подтвержденными механизмами передачи сигналов.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает высокопроизводительное количественное определение cAMP в планшетах для кампаний по скринингу соединений.
- Стандартизирует результаты анализа с помощью надежных и воспроизводимых измерений флуоресценции для различных типов клеток.
- Позволяет быстро сравнивать влияние соединений на динамику cAMP как в популяционном, так и в одноклеточном форматах.
- Поддерживает масштабируемую разработку анализа для рабочих процессов скрининга и идентификации перспективных соединений-лидеров.
Трансляционные и доклинические исследования
- Позволяет сопоставить результаты измерений сигналинга cAMP с моделями первичных клеток, имеющих значение для заболевания, такими как клетки HASM.
- Обеспечивает трансляционную преемственность от этапа открытия до доклинической валидации, позволяя проводить анализы на уровне отдельных клеток и популяций.
- Способствует принятию обоснованных с учетом рисков решений о дальнейшем продвижении на основе количественных данных о путях передачи сигнала в режиме реального времени.
- Поддерживает согласование биомаркеров для респираторных и других заболеваний, при которых задействован сигналинг cAMP.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Биосенсор cADDis интегрируется в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, обеспечивая возможность проверки гипотез, проведения скрининга и трансляционных исследований в системах живых клеток.
- Биология открытий: способствует уточнению сигнальных путей и снижению биологических рисков за счет количественного определения cAMP в режиме реальногого времени.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа и воспроизводимость для высокопроизводительной оценки соединений.
- Аналитика: предоставляет количественные данные флуоресценции и статистический анализ динамики cAMP при различных условиях.
- Трансляционные исследования: связывает этап открытий с доклинической валидацией на моделях первичных клеток человека.
- Корпоративное повторное использование: предлагает гибкую, многократно используемую платформу для различных типов клеток и планов экспериментов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неоднозначность при валидации мишеней.
- Операционная ценность: Улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость анализов cAMP.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет предоставления надежных данных о сигнальных путях.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию с учетом рисков и продвижение программ по поиску новых лекарственных средств.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области визуализации живых клеток и разработки методов флуоресцентного анализа.
- Необходим доступ к планшетным ридерам и инфраструктуре для флуоресцентной микроскопии.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов культивирования клеток и проведения анализов.
- Метод может быть адаптирован как для иммортализованных, так и для первичных клеточных систем при условии оптимизации протокола.
- Результат зависит от надежной доставки вектора и его экспрессии в целевых типах клеток.
