DNAzyme 10-23 - Наномашины для распознавания нуклеиновых кислот
9 февраля 2024 г.
Наномашины на основе ДНКферментов могут быть использованы для высокоселективного и чувствительного детектирования нуклеиновых кислот. В данной статье описан подробный протокол проектирования наномашин на основе ДНКферментов с ядром 10-23 с использованием свободного программного обеспечения и их применение при обнаружении фрагмента вируса Эпштейна-Барр в качестве примера.
Самый большой прорыв в области гибридизационных зондов был сделан в 2007 году Дмитрием Колпащиковым, который предложил ADL, расщепляющий гибридизационные зонды пополам, оценивая каждую из половин своей функции, например, увеличивая селективность к несоответствиям и однонуклеотидные вариации по мере раскручивания сложных зондов. Второй прорыв был сделан десятилетие спустя, когда было предложено добавить дополнительные многокомпонентные связующие руки. Вместе с платформой Unitan.
Такие конструкции были способны работать даже со сложными мишенями, например, с двухцепочечными нуклеиновыми кислотами, и высокоструктурированными нуклеиновыми кислотами. Самые большие проблемы, с которыми сейчас сталкивается наша лаборатория, связаны с проблемой низкой чувствительности наносенсоров ДНК по сравнению с традиционными методами амплификации. К настоящему времени наносенсоры ДНК в анализе без амплификации обладают низкой селективностью, и мы пытаемся решить эту проблему с помощью новых молекулярных конструкций и новых способов обнаружения наносенсоров ДНК.
Основными преимуществами наших ДНК-сенсоров являются их чувствительность с точки зрения низкой обнаруживаемой концентрации аналита и селективности. Например, их способность обнаруживать однонуклеотидный полиморфизм также является преимуществом по сравнению с другими методами диагностики. Наши датчики ДНК способны раскручивать и обнаруживать сложные структуры РНК и двухцепочечную ДНК.
Новый научный вопрос, к которому наши результаты проложили путь, заключается в том, можно ли найти двухцепочечную ДНК с использованием безбелковых гибридизационных реквизитов? Независимый от белка реквизит может быть легко доступен благодаря автоматизированному синтезу ДНК, легче доставляться в клетки и быть совместимым с химической модификацией и сложными наноструктурами, разработанными с помощью нанотехнологий ДНК, в сочетании с ферментами ДНК, такими как липиды Dnase и ферменты ДНК. Такая опора могла бы стать основой для безбелковых нуклеаз, полезным инструментом для редактирования генов и терапии.
Обзор
В данной статье рассматривается разработка наномашин на основе ДНАЗимов для селективного и чувствительного детектирования нуклеиновых кислот. В ней представлен подробный протокол проектирования таких наномашин с использованием свободного программного обеспечения на примере их применения для обнаружения фрагмента вируса Эпштейна — Барр.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биотехнология
- Молекулярная биология
- Нанотехнология
Теоретическая часть
- ДНКзимы представляют собой синтетические ферменты на основе нуклеиновых кислот.
- Они способны катализировать специфические биохимические реакции.
- Предыдущие достижения позволили повысить их селективность и чувствительность.
- По-прежнему остаются проблемы с улучшением их эффективности по сравнению с традиционными методами.
Цель исследования
- Спроектировать наномашины на основе ДНАЗимов для детектирования нуклеиновых кислот.
- Продемонстрировать их применение для обнаружения вирусных фрагментов.
- Решить проблемы чувствительности и селективности ДНК-сенсоров.
Используемые методы
- Проектирование наномашин на основе ДНКзимов с использованием свободного программного обеспечения.
- Применение спроектированных наномашин для детектирования фрагментов вируса Эпштейна-Барр.
- Оценка чувствительности и селективности в сравнении с традиционными методами.
- Использование многокомпонентных связывающих плеч для сложных мишеней.
Основные результаты
- Успешное проектирование наномашин на основе ДНЗимов.
- Продемонстрирована высокая селективность при детектировании нуклеиновых кислот.
- Выявлены проблемы с чувствительностью по сравнению с методами амплификации.
- Предложены новые молекулярные конструкции для повышения эффективности.
Выводы
- Наномашины на основе ДНКзимов являются перспективными для детектирования нуклеиновых кислот.
- Для повышения чувствительности и селективности необходимы дальнейшие усовершенствования.
- Будущая работа будет сосредоточена на преодолении текущих ограничений.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Наномашины на основе ДНКзима 10-23 обеспечивают высокоселективное и чувствительное распознавание нуклеиновых кислот, решая критические задачи ранней молекулярной диагностики и валидации мишеней. Их способность различать однонуклеотидные замены и обнаруживать аналиты в экстремально низких концентрациях повышает прогностическую достоверность при поиске биомаркеров и разработке анализов. Эти безбелковые модульные конструкции предлагают масштабируемые и воспроизводимые решения для рабочих процессов детекции нуклеиновых кислот в рамках фундаментальных и трансляционных исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Обеспечивает анализ мишеней нуклеиновых кислот с однонуклеотидной специфичностью для надежной валидации мишеней.
- Способствует снижению биологических рисков за счет разграничения близкородственных генетических вариантов в сложных образцах.
- Повышает прогностическую достоверность при ранней идентификации биомаркеров и сортировке портфеля проектов.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет подготавливать валидированные системы детекции нуклеиновых кислот для последующего высокопроизводительного скрининга.
- Обеспечивает количественные результаты на основе флуоресценции для разработки стандартизированных анализов.
- Обеспечивает воспроизводимую и масштабируемую детекцию аналитов ДНК и РНК без использования белковых ферментов.
- Поддерживает надежную оценку молекулярных зондов и диагностических кандидатов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует стратегиям разработки трансляционных биомаркеров, обеспечивая возможность обнаружения значимых для заболевания сигнатур нуклеиновых кислот.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа поиска до доклинической валидации с помощью модульных, химически доступных зондов.
- Снижает механистическую неопределенность при разработке диагностических средств на основе нуклеиновых кислот.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Наномашины на основе ДНК-зимов интегрируются в континуум от открытия до доклинических исследований в качестве многоразовой платформы для распознавания нуклеиновых кислот, поддерживая рабочие процессы от проверки гипотез до идентификации ведущих соединений и трансляционной валидации биомаркеров.
- Биология открытий: Содействует проверке гипотез и уточнению путей за счет обеспечения точного анализа целевых нуклеиновых кислот.
- Скрининг: Обеспечивает количественные показатели флуоресценции, готовые к анализу, для сравнительной оценки эффективности зондов.
- Аналитика: Предоставляет чувствительные и воспроизводимые измерения для сравнения различных условий и образцов.
- Трансляционные исследования: Поддерживает согласование биомаркеров и преклиническую преемственность с помощью модифицируемых безбелковых зондов.
- Корпоративное повторное использование: Предлагает модульную масштабируемую систему детекции, адаптируемую под различные мишени нуклеиновых кислот и модельные системы.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при детектировании нуклеиновых кислот.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость рабочих процессов анализа.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет снижения биологических рисков на поздних этапах.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации с учетом рисков и продвижению программ по разработке диагностикумов и биомаркеров.
Особенности реализации
- Требуется опыт в дизайне нуклеиновых кислот, анализе фолдинга и методах детекции на основе флуоресценции.
- Необходим доступ к синтезу олигонуклеотидов, ПАГ-анализу и флуориметрическим планшетным ридерам.
- Требуется межкомандная стандартизация дизайна зондов и условий анализа для обеспечения воспроизводимости.
- Метод адаптируется к различным мишеням из нуклеиновых кислот и совместим с химическими модификациями.
- Текущая чувствительность может быть ниже, чем у методов на основе амплификации, что требует постоянной оптимизации.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:38
Designing DNAzyme‐Based Nanomachines with a 10‐23 Core for Detection of an Epstein‐Barr Virus Fragment
4:30
Assembly of DNAzyme‐Based Nanomachines for its Functional Characterization
5:59
Limit of Detection (LOD) Assay to Check the Sensitivity of DNAzyme-Based Nanomachines (DNM)
