Высокоскоростная атомно-силовая микроскопия: визуализация самосборки мотива ДНК в виде трехконечной звезды с использованием фототермического внерезонансного таппинга

В нашей лаборатории мы разрабатываем новые измерительные технологии для наноразмерной биологии. В частности, особое внимание уделяется развитию высокоскоростной атомно-силовой микроскопии для изучения динамических биологических процессов в нанометровом масштабе. Для этого мы недавно разработали новый режим визуализации, который мы называем фототермическим выключенным резонансным таппингом, или PORT.

В этом режиме мы используем специальный приводной лазер для приведения в действие консолей с высокой скоростью, что позволяет нам получать данные на два порядка быстрее, чем при обычном внерезонансном постукивании. Золотым стандартом высокоскоростной АСМ является резонансная визуализация. В этом режиме кантилевер приводится в действие на этой резонансной частоте, а это значит, что положением кантилевера управлять нельзя, только амплитудой его колебаний.

Для АСМ с нормальным быстродействием все чаще используются внерезонансные моды. Однако частота срабатывания здесь ограничена, что делает эти режимы визуализации довольно медленными. Используя вторичный лазер для приведения в действие кантилевера, мы можем достичь более высоких частот срабатывания, что означает более высокую скорость визуализации.

Такой подход позволяет нам сохранить преимущества, связанные с другими внерезонансными режимами работы персонала, а это означает, что мы можем оптимизировать баланс между чувствительностью и скоростью визуализации. Мы ограничены в скорости изображения самым высоким портретом. Если мы хотим увеличить портрет, нам необходимо увеличить мощность лазера, чтобы сохранить ту же амплитуду срабатывания.

Это может привести к плохому контролю усилия и повреждению образца. Увеличение полосы пропускания консолей за счет уменьшения их размера и повышения эффективности поглощения лазера позволит нам достичь более высоких скоростей портирования при обеспечении достаточного клиренса образца. Это усовершенствование будет способствовать более высокой скорости визуализации, что имеет решающее значение для изучения тонкостей динамики сборки.

Для начала очистите и подготовьте консоли. Установите кантилеверы на держатель, совместимый с системой сканирующей электронной микроскопии или СЭМ. Затем нагрейте прекурсор, который будет использоваться в системе впрыска газа, чтобы вырастить новый наконечник.

Как только вакуум опустится ниже 10 и составит минус пять миллибар, продуйте линию впрыска газа 10 раз в течение двух секунд каждый, чтобы удалить остаточный воздух из линии сопла. Используйте SEM для определения конца консоли. Наклоните держатель под углом, чтобы правильно выровнять консоль для визуализации атомно-силовой микроскопии.

Отрегулируйте положение и фокус SEM для четкого обзора консоли, где будет выращиваться углеродный нанонаконечник. Далее задайте параметры осаждения в программном обеспечении, чтобы вырастить новый наконечник. Начните процесс осаждения для увеличения наконечника излучением электронного пучка на кончике кантилевера во время впрыска газа-прекурсора и остановите впрыск газа после завершения осаждения.

Выполните визуализацию СЭМ после роста для оценки качества и характеристик вновь выращенного кончика, включая его радиус и длину. Извлеките держатель из камеры SEM. Для начала подготовьте высокоскоростной атомно-силовой микроскоп.

С помощью пинцета поместите ультракороткий кантилевер под пружинный зажим на держателе консоли. С помощью шприца добавьте 50 микролитров жидкости через левое отверстие для доступа жидкости. Затем с помощью трех ручек на головке АСМ выровняйте считывающий лазер на консоли.

Наблюдайте за тенью кантилевера на белой бумаге, увеличивая сумму. Затем центрируйте лазерное пятно на фотодиоде с помощью двух специальных ручек. Затем установите флажок «Возбуждение» в возбуждении VI, чтобы включить и выровнять приводной лазер, приводящий в действие и вращающий консоль.

Отображение сигналов возбуждения и отклонения кантилевера на осциллографе. Используйте метод тени и максимизируйте амплитуду колебаний с помощью ручек регулировки лазерного привода. Чтобы отрегулировать амплитуду колебаний кантилевера в порту, добавьте напряжение постоянного тока в цепь управления лазерным диодом в окне конфигурации в режиме возбуждения VI и введите размах напряжения переменного тока для схемы управления лазерным диодом.

Чтобы получить кривые взаимодействия, установите Z-контроллер VI в контактный режим и нажмите кнопку Пуск, чтобы приблизиться к поверхности образца. Достигнув поверхности, выполните кривую зависимости силы от расстояния в рампе VI для калибровки чувствительности кантилевера к отклонению. Нажмите кнопку «Вытащить», чтобы втянуть Z-пьезо с поверхности, до которой кончик не может дотянуться.

После полного втягивания переключитесь в режим порта в контроллере Z VI и включите лазер возбуждения в возбуждении VI. Установите режим порта на нужную частоту. Четкие кривые взаимодействия были получены путем вычитания свободных колебаний из контактных колебаний, имеющих решающее значение для неразрушающей визуализации биологических образцов. При скорости порта 100 килогерц было достигнуто хорошее качество изображения.

Однако, по мере приближения частоты возбуждения к консольному резонансу, управление обратной связью ухудшалось, что приводило к искажению кривых взаимодействия и ухудшению качества изображения. Для начала приготовьте 10 миллимолярный раствор ацетата магния. С помощью шприца Гамильтона введите 50 микролитров раствора в жидкостный канал держателя кантилевера, создавая каплю жидкости, которая охватывает консоль.

Установите размер сканирования в сканировании VI на 800 на 800 нанометров, а скорость линии — на 100 герц. Чтобы отсканировать поверхность, нажмите стрелку рамки, чтобы проверить качество. После сканирования нажмите кнопку «Снять» в контроллере Z VI, чтобы втянуть консоль от поверхности.

С помощью шприца Гамильтона извлеките буферный раствор из держателя кантилевера. Затем приготовьте разбавленный раствор ДНК в виде трехточечной звезды и введите 50 микролитров этого раствора в держатель кантилевера. Выполняйте визуализацию с областью 800 x 800 нанометров с частотой линии по умолчанию 100 Гц.

После первоначального сканирования отрегулируйте размер и скорость визуализации и выполните сканирование VI до заданных значений для дальнейшего сбора данных Поддерживайте ввод заданного значения в поле VI контроллера Z на самом низком уровне, необходимом для точного отслеживания на протяжении всего процесса визуализации. Повторите это для всех необходимых областей образца. С помощью этого протокола высокоскоростная портовая АСМ наблюдала сборку в реальном времени мотивов трехточечных звезд ДНК в стабильные острова.

Четкие изображения были получены при скоростях линии 100 и 200 Гц при скорости порта 100 килогерц. Однако более высокая скорость обработки изображений без увеличения скорости портов снижает качество изображения из-за быстрых изменений топографии. Результаты визуализации трехконечной звезды ДНК при самом низком поступлении переменного тока от пика до пика показали неповрежденные структуры, в то время как самый высокий вход переменного тока от пика к пику привел к наблюдаемому повреждению образца из-за более высоких сил.

Аналогичным образом, при самом низком входе смещения постоянного тока обнаруживались неповрежденные структуры, в то время как при самом высоком входе смещения постоянного тока наблюдались повреждения конструкции.