Гемостаз пункционной раны и подготовка образцов для анализа методом широкоугольной электронной микроскопии
24 мая 2024 г.
Здесь представлена процедура колотой раны при образовании гемостатического тромба. Образующиеся тромбы имеют большие размеры и достигают сотен микрон в диаметре. Следовательно, подходят подходы к объемной визуализации. Мы предлагаем смонтированную широкозонную просвечивающую электронную микроскопию в качестве подхода с высоким разрешением, доступного многим, и детализируемого препаративного протокола.
Мы являемся лабораторией, которая проводит объемную ЭМ, структурную работу, чтобы сказать, как активируются тромбоциты, как они агрегируются? Как они образуют тромб, который приводит к остановке кровотечения и как в случае чрезмерной стимуляции они приводят к окклюзионному свертыванию. При этом предпосылка заключается в том, что если мы знаем структуру, мы можем лучше нацеливаться на лекарства и добиваться лучших результатов.
Мы используем мышиные модели в наших исследованиях, как и многие другие исследователи, и все мы сталкиваемся с проблемой установления того, как наши результаты на мышах, а в нашем случае на артериях и венах мышей, переносятся на механизмы в гораздо более крупных артериях и венах человека. Мы все надеемся, что принципы у мышей и людей одинаковы. Если вы возьмете нашу работу и используете объемные электромагнитные подходы, то увидите, что большое достижение, которое мы сделали, заключается в том, что тромбоциты — это не просто террористы-смертники.
Они удерживают гранулы. Они делают что-то в ответ на сигналы. У них есть стабильные состояния, и эти стабильные состояния являются частью нормального тромба, а также частью включающего сгустка.
Во-вторых, мы принесли ощущение, что у формирующегося тромба действительно есть структура, это не просто груда кирпичей, а скорее упорядоченная структура, в которой тромбоциты упорядочены в зависимости от их активации и так далее. И в-третьих, мы принесли ощущение, что нужно уметь применять и понимать на основе структуры, что нужно либо стимулировать, чтобы получить хороший результат, либо что нужно подавить, чтобы получить результат, который защитит людей от плохих результатов. Мы собираем последовательные изображения в масштабе, близком к нанометровому, на почти миллиметровых расстояниях.
Мы собираем их в единое смонтированное изображение. Следовательно, мы можем наблюдать любое заданное пятно на изображении в масштабе от нанометров до почти миллиметров, что достаточно для размещения отдельных особенностей внутри всего тромба. Теперь у исследователей есть мощный инструмент, и они могут задать новый вопрос: как каскады коагуляции и клеточные сигналы или лекарства действуют пространственно на локальном и глобальном уровнях в тромбах?
Обзор
В данной статье представлена методика создания колотой раны для изучения формирования гемостатического тромба с акцентом на крупных тромбах, образующихся в ходе этого процесса. В качестве метода визуализации с высоким разрешением для анализа этих структур предлагается использование монтажной просвечивающей электронной микроскопии больших полей.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Гемостаз
- Формирование тромба
Теоретические основы
- Понимание процессов активации и агрегации тромбоцитов имеет решающее значение для обеспечения остановки кровотечения.
- Целью исследований является перенос данных, полученных на моделях мышей, на механизмы функционирования сосудов человека.
- Известно, что тромбоциты сохраняют гранулы, что ставит под сомнение прежние представления об их функциях.
- Методы объемной электронной микроскопии позволяют получить представление о структуре тромба.
Цель исследования
- Изучить структурные аспекты формирования тромба.
- Улучшить адресную доставку лекарств для достижения лучших клинических результатов.
- Исследовать сходство сосудистых реакций у мышей и людей.
Используемые методы
- Процедура создания прокола для формирования тромба.
- Объемная электронная микроскопия для визуализации тромбов.
- Мышиные модели для изучения поведения тромбоцитов.
- Сравнительный анализ результатов, полученных на мышах и людях.
Основные результаты
- Образующиеся тромбы имеют большой размер, достигая сотен микрон в диаметре.
- Тромбоциты сохраняют гранулы, что указывает на более сложную роль в гемостазе.
- Объемная электронная микроскопия позволяет детально изучить структурные особенности формирования тромба.
- Полученные данные подтверждают предположение о том, что модели на мышах могут дать представление о механизмах сосудистых процессов у человека.
Выводы
- Данное исследование углубляет понимание структуры тромба и функции тромбоцитов.
- Объемная электронная микроскопия (Volume EM) является ценным инструментом для получения изображений высокого разрешения в исследованиях гемостаза.
- Необходимы дальнейшие исследования для подтверждения полученных результатов в системах человека.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Монтажная широкопольная электронная микроскопия тромбов в прокольных ранах обеспечивает беспрецедентное структурное разрешение гемостатических процессов, что способствует механистическому снижению рисков при ранней валидации сердечно-сосудистых мишеней. Этот подход устраняет разрыв между результатами исследований на животных моделях и биологией сосудов человека, определяя трансляционные стратегии поиска антитромботических препаратов. Высокоразрешающее картирование архитектуры тромба повышает точность прогнозирования взаимодействия с мишенью и оценки функциональных результатов на всех этапах разработки.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Структурное картирование тромбов позволяет выяснить состояния активации тромбоцитов и их пространственную организацию.
- Объемная электронная микроскопия (Volume EM) обеспечивает механистическое снижение рисков путем разграничения гемостаза и патологического тромбоза.
- Количественная визуализация способствует функциональной валидации мишеней и приоритизации антитромботических кандидатов.
Скрининг и разработка анализа
- Валидированные протоколы подготовки образцов обеспечивают воспроизводимость результатов визуализации для последующего анализа.
- Смонтированные наборы данных электронной микроскопии (ЭМ) предоставляют стандартизированные количественные показатели для сравнительных исследований.
- Визуализация высокого разрешения способствует достоверной оценке влияния соединений на структуру тромба.
Трансляционные и доклинические исследования
- Результаты исследования на мышиной модели обеспечивают трансляционную преемственность путем сопоставления структурных биомаркеров с механизмами сосудистых реакций у человека.
- Визуализация с пространственным разрешением позволяет обосновывать продвижение кандидатов, нацеленных на функцию тромбоцитов, с учетом возможных рисков.
- Количественные структурные данные позволяют проводить межвидовое сравнение для доклинической валидации.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод охватывает все этапы — от раннего поиска до доклинических исследований, обеспечивая проверку гипотез, валидацию мишеней и трансляционное согласование при разработке сердечно-сосудистых лекарственных препаратов.
- Открывающая биология: позволяет проводить исследования функций тромбоцитов и архитектуры тромбов на основе выдвинутых гипотез.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные результаты визуализации для оценки соединений.
- Аналитика: предоставляет высококонтентные структурные наборы данных для надежного статистического сравнения экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: способствует согласованию биомаркеров и обеспечению преемственности данных от мышиных моделей к клинически значимым аспектам для человека.
- Корпоративное повторное использование: создает масштабируемую платформу визуализации для многократного применения в различных программах сердечно-сосудистых исследований.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неопределенность при поиске мишеней, нацеленных на тромбы.
- Операционная ценность: стандартизирует процессы подготовки образцов и визуализации для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: служит основой для принятия решений о продолжении или прекращении разработок («go/no-go») и повышает эффективность использования капитала за счет раннего выявления биологических рисков.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритезацию антитромботических мишеней и кандидатов с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области электронной микроскопии и биологии сосудов.
- Необходим доступ к современному оборудованию для визуализации и программному обеспечению с возможностью создания монтажей.
- Требуется строгая стандартизация протоколов подготовки образцов между всеми участниками исследования.
- Может потребоваться адаптация метода для различных моделей сосудов или видов.
- Пропускная способность при обработке образцов и управление данными могут ограничить масштабируемость крупных исследований.
