Трехмерные модели клеточных культур для исследования эпителиального барьера при эозинофильном эзофагите
10 мая 2024 г.
1.8K просмотров
Здесь представлен протокол культивирования органоидов пищевода человека и культуры границы раздела воздух-жидкость. Культура воздушно-жидкостного интерфейса органоидов пищевода может быть использована для изучения влияния цитокинов на эпителиальный барьер пищевода.
Мы исследуем патофизиологию эозинофильного эзофагита и пытаемся разгадать воспалительный каскад, вызывающий и способствующий хроническому воспалительному процессу ЭОЭ. Идентификация новых иммунных медиаторов, способствующих патогенезу заболевания, была сосредоточена вокруг нарушения эпителиального барьера и одобрения терапевтических антител против указанных иммунных медиаторов. Мы идентифицировали цитокины подсемейства IL-20 как медиаторы воспаления, которые нарушают эпителиальную дифференцировку и кератинизацию, что приводит к нарушению эпителиального барьера через путь MAP-киназы.
Обзор
В данной статье представлен протокол культивирования органоидов пищевода человека и использования метода культивирования на границе раздела воздух-жидкость для исследования влияния цитокинов на эпителиальный барьер пищевода.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Иммунология
Теоретические основы
- Эозинофильный эзофагит (EoE) характеризуется хроническим воспалением.
- Нарушение эпителиального барьера занимает центральное место в патогенезе EoE.
- Для понимания их роли при EoE выявляются новые иммунные медиаторы.
- Цитокины подсемейства IL-20 были связаны с нарушением эпителиального барьера.
Цель исследования
- Изучить воспалительный каскад при эозинофильном эзофагите.
- Идентифицировать иммунные медиаторы, влияющие на функцию эпителиального барьера.
- Разработать терапевтические стратегии, направленные на эти медиаторы.
Используемые методы
- Образцы биопсии пищевода культивируют в безсывороточной среде для кератиноцитов.
- Для переваривания биоптатов с целью дальнейшего анализа используют диспазу 1.
- Для изучения эффектов цитокинов применяется культивирование на границе раздела фаз «воздух-жидкость».
- Исследуется роль сигнального пути MAP-киназы в нарушении целостности эпителия.
Основные результаты
- Идентификация цитокинов подсемейства IL-20 в качестве ключевых медиаторов воспаления.
- Демонстрация их влияния на дифференцировку и кератинизацию эпителия.
- Доказательство индуцированного цитокинами нарушения эпителиального барьера.
- Представление о роли сигнального пути MAP-киназ при эозинофильном эзофагите (EoE).
Выводы
- Данное исследование углубляет понимание патофизиологии EoE.
- В нем выделены потенциальные терапевтические мишени для медицинского вмешательства.
- Будущие исследования могут быть сосредоточены на модуляции цитокинов для восстановления барьерной функции.
Часто задаваемые вопросы
Что такое эозинофильный эзофагит?
Эозинофильный эзофагит — это хроническое иммуноопосредованное заболевание, характеризующееся инфильтрацией пищевода эозинофилами, что приводит к воспалению и повреждению тканей.
Как цитокины влияют на барьер пищевода?
Цитокины могут нарушать дифференцировку и кератинизацию эпителия, что приводит к нарушению целостности эпителиального барьера пищевода.
Какую роль играет путь MAP-киназы в данном исследовании?
Путь МАП-киназы исследуется на предмет его участия в индуцированном цитокинами нарушении эпителиального барьера при эозинофильном эзофагите.
В чем заключается значение использования культуры на границе раздела фаз «воздух-жидкость»?
Культивирование на границе раздела фаз «воздух-жидкость» позволяет создать более физиологически релевантную среду для изучения влияния цитокинов на эпителиальные клетки.
Каковы потенциальные терапевтические последствия данного исследования?
Идентификация иммунных медиаторов может привести к созданию методов таргетной терапии, восстанавливающих функцию эпителиального барьера при эозинофильном эзофагите.
Как подготавливают образцы биопсии пищевода для исследования?
Образцы биопсии погружают в бессывороточную среду для кератиноцитов и обрабатывают диспазой 1 для облегчения изоляции клеток для культивирования.
Промышленная значимость
Трехмерные модели органоидов пищевода и модели раздела «воздух-жидкость» позволяют механистически снизить риски при изучении дисфункции эпителиального барьера при эозинофильном эзофагите. Эти системы, полученные из клеток пациентов, обеспечивают прогностическую уверенность при валидации мишеней и исследовании сигнальных путей, поддерживая трансляционную преемственность от этапа открытия до доклинических исследований. Их использование способствует принятию решений по формированию портфеля препаратов за счет уточнения влияния цитокинов и сигнальных путей на целостность барьера.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать механизмы воздействия цитокинов, лежащие в основе нарушения эпителиального барьера.
- Обеспечивает функциональную валидацию иммунных медиаторов и сигнальных путей в тканях, имеющих значение для заболевания.
- Способствует снижению биологических рисков путем моделирования специфических для пациента эпителиальных ответов.
- Предоставляет платформу для повышения точности прогнозирования при выборе и приоритизации мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет подготавливать валидированные системы органоидов и интерфейса «воздух-жидкость» для количественного анализа барьерной функции.
- Обеспечивает воспроизводимое измерение трансэпителиального электрического сопротивления и потока макромолекул.
- Поддерживает стандартизацию анализа для последующего скрининга химических соединений или биологических препаратов.
- Позволяет проводить масштабируемую оценку влияния потенциальных терапевтических воздействий на целостность эпителия.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет модели барьера in vitro с фенотипами пациентов, имеющими значение для конкретного заболевания.
- Сохраняет донор-специфичные генетические и фенотипические свойства для трансляционных исследований биомаркеров.
- Позволяет проводить риск-ориентированную проверку терапевтических гипотез, направленных на устранение эпителиальной дисфункции.
- Обеспечивает преемственность от этапа выявления механизмов до доклинической валидации стратегий восстановления барьера.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Эти модели связывают этап ранних открытий и доклинические исследования, позволяя проводить проверку гипотез, количественную оценку барьерной функции и анализ путей в системах, созданных на основе клеток пациентов.
- Фундаментальная биология: обеспечивает возможность механистического изучения влияния цитокинов и сигнальных путей на эпителиальную дифференцировку и барьерную функцию.
- Скрининг: позволяет получать воспроизводимые количественные данные, такие как TEER и поток макромолекул, для сравнительного анализа.
- Аналитика: предоставляет данные транскриптомного и протеомного анализа после стимуляции цитокинами для картирования сигнальных путей.
- Трансляционные исследования: обеспечивает соответствие патологическим процессам и биомаркерам за счет использования первичных клеток пациентов.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу для постоянной валидации мишеней и механистических исследований нарушений эпителиального барьера.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неопределенность в исследованиях дисфункции барьера.
- Операционная ценность: стандартизирует и масштабирует модельные системы на основе клеток пациентов для получения воспроизводимых результатов.
- Стратегическая ценность: служит основанием для принятия решений о продолжении или прекращении разработки и снижает биологические риски на поздних стадиях в портфелях препаратов, нацеленных на эпителий.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритезацию терапевтических кандидатов, направленных на восстановление эпителиального барьера, с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области выделения первичных клеток и методов 3D-культивирования.
- Необходим доступ к специализированным культуральным средам, матриксам и аналитическому оборудованию для измерения TEER и анализа потока.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов для обеспечения воспроизводимости.
- Может потребоваться адаптация для различных когорт пациентов или подтипов заболеваний.
- Достоверность модели зависит от качества образцов биопсии и вариабельности доноров.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Почему проверка нулевой гипотезы важна при изучении нарушения барьерной функции, вызванного цитокинами?
Проверка нулевой гипотезы позволяет объективно оценить, приводят ли конкретные цитокины, такие как представители подсемейства IL-20, к значимому изменению функции эпителиального барьера в моделях органоидов и интерфейса «воздух-жидкость». Такая статистическая строгость необходима для валидации мишеней и снижения механистических рисков на ранних этапах поиска. Это обеспечивает уверенное продвижение только тех мишеней, которые оказывают воспроизводимое и значимое влияние на целостность барьера.
Как изоляция независимых переменных применяется в анализах TEER на границе раздела фаз «воздух-жидкость»?
Изоляция таких переменных, как концентрация цитокинов или ингибиторы сигнальных путей, в анализах TEER позволяет точно связать наблюдаемые изменения барьерной функции с конкретными воздействиями. Такой подход углубляет понимание механизмов и способствует созданию надежных методов анализа для последующего скрининга. Это гарантирует, что кросс-функциональные группы смогут интерпретировать результаты с высокой степенью прогностической достоверности.
Что позволяют определить количественные измерения TEER и потока макромолекул?
Количественные измерения TEER и потока макромолекул обеспечивают объективные и воспроизводимые показатели целостности эпителиального барьера в ответ на стимуляцию цитокинами или исследуемые вмешательства. Эти данные позволяют проводить прямое сравнение различных экспериментальных условий и способствуют принятию обоснованных решений при разработке анализа и поиске перспективных соединений. Они имеют решающее значение для подтверждения готовности анализа и надежности скрининга.
Почему требования к репликации важны для кросс-функционального взаимодействия?
Воспроизведение экспериментов с органоидами и интерфейсом «воздух-жидкость» гарантирует, что наблюдаемые эффекты в функции барьера являются устойчивыми и воспроизводимыми в разных группах и исследованиях. Эта надежность имеет решающее значение для межфункционального сотрудничества, обеспечивая согласованную интерпретацию данных и снижая риски при развитии портфеля препаратов. Стандартизированное воспроизведение поддерживает уверенность всего предприятия в результатах моделирования.
Какие возможности статистического анализа необходимы перед проведением анализов барьерной функции?
Для проведения анализов барьерной функции требуются статистические инструменты для проверки гипотез, анализа дисперсии и определения значимости данных TEER и потока. Эти возможности гарантируют, что в процессе разработки продвигаются только те вмешательства, эффекты которых статистически подтверждены. Тщательный аналитический подход лежит в основе надежных решений о продолжении или прекращении исследований, а также приоритезации портфеля проектов.
