Характеристика модуляторов рецепторов, активируемых протеазой, с помощью анализа мобилизации кальция с использованием планшетного ридера
24 мая 2024 г.
Разработан усовершенствованный протокол анализа мобилизации кальция с эндотелиальными клетками, используемый для идентификации лигандов рецепторов, активируемых протеазой (ФАР). Новый протокол сокращает общее время анализа на 90-120 минут и позволяет получать воспроизводимые кривые «концентрация-реакция».
Наша лаборатория работает над тем, чтобы понять, как модуляция рецепторов, активированных протеазой, может подавлять воспаление. Мы разработали новый класс малых молекул под названием пармодулины, которые модулируют активность PAR1. Цель состоит в том, чтобы обнаружить пармодулины с улучшенными свойствами для потенциального использования в качестве кандидатов в лекарственные препараты, а также понять их механизм действия.
В доклинических исследованиях с нашими коллегами мы определили, что пармодулины могут быть особенно перспективными для лечения расстройств, вызванных тромбовоспалением, включая заболевания почек, печени и сердечно-сосудистые заболевания. Их механизм действия также может позволить разработать соединения с лучшим профилем безопасности, чем предыдущие PAR1, нацеленные на кандидаты в лекарственные препараты. Рецептор PAR1 важен для активации тромбоцитов, но его передача сигналов в эндотелиальных клетках также важна и актуальна при многочисленных патологиях.
Поэтому мы хотели разработать дешевый и удобный протокол для тестирования активности пармодулинов и культивируемых эндотелиальных клеток. Мы здесь, чтобы поделиться обновленным протоколом измерения мобилизации кальция, который использует стандартный считыватель пластин и не требует автоматизированного обработчика жидкостей. Он подходит для скрининга лигандов PAR1 в эндотелиальных клетках, но теоретически его можно использовать для измерения активности любых соединений, влияющих на мобилизацию кальция.
Обзор
В данной работе представлен усовершенствованный протокол анализа мобилизации кальция в эндотелиальных клетках, предназначенный для идентификации лигандов протеаза-активируемых рецепторов (PAR). Новый метод значительно сокращает время проведения анализа и повышает воспроизводимость результатов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Фармакология
Теоретические основы
- Протеаза-активируемые рецепторы (PAR) играют ключевую роль в различных физиологических процессах.
- Модуляция PAR может влиять на воспаление и другие патологии.
- Для воздействия на эти рецепторы были разработаны малые молекулы, такие как пармамодлины.
- Понимание механизма их действия может привести к созданию более эффективных терапевтических методов.
Цель исследования
- Разработать более эффективный метод анализа для изучения PAR.
- Выявить потенциальные лекарственные препараты-кандидаты, модулирующие активность PAR.
- Изучить терапевтическое значение пармамодлинов при тромбовоспалительных заболеваниях.
Используемые методы
- Анализ мобилизации кальция в эндотелиальных клетках.
- Оценка кривых «концентрация-ответ».
- Доклинические исследования по оценке эффективности пармамодлинов.
- Сотрудничество с другими исследовательскими группами для проведения комплексного анализа.
Основные результаты
- Новый протокол сокращает общее время анализа на 90–120 минут.
- Были получены воспроизводимые кривые «концентрация — ответ».
- Пармамодлины продемонстрировали многообещающие результаты в доклинических исследованиях при лечении тромбовоспалительных заболеваний.
- Потенциал улучшения профилей безопасности по сравнению с предыдущими лекарственными кандидатами, нацеленными на PAR 1.
Выводы
- Усовершенствованный протокол анализа расширяет возможности изучения PAR.
- Пармамодлины представляют собой новый класс соединений с терапевтическим потенциалом.
- Для полного понимания механизма их действия необходимы дальнейшие исследования.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Высокопроизводительные количественные анализы мобилизации кальция с использованием стандартных планшетных ридеров позволяют масштабировать характеристику модуляторов рецепторов, активируемых протеазами (PAR), в эндотелиальных системах. Данный рабочий процесс поддерживает валидацию мишеней на ранних стадиях и снижение механистических рисков при разработке противовоспалительных препаратов, в частности, новых малых молекул, таких как пармодулины. Этот подход повышает прогностическую достоверность и эффективность сортировки портфеля препаратов, обеспечивая воспроизводимый скрининг средней пропускной способности без необходимости использования дорогостоящей автоматизации.
Стратегические приложения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет проводить функциональный анализ сигналинга PAR1 в эндотелиальных клетках, имеющих значение для патологии заболеваний.
- Обеспечивает механическое снижение рисков путем количественной оценки влияния лигандов на Gαq-опосредованный поток ионов кальция.
- Облегчает сравнительную оценку новых соединений пармодулина на предмет их противовоспалительного потенциала.
- Предоставляет платформу для проверки гипотез по валидации мишеней в тромбовоспалительных путях.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированные и воспроизводимые показатели мобилизации кальция, подходящие для скрининга в 96-луночных планшетах.
- Снижает операционную сложность за счет исключения необходимости в автоматических станциях для работы с жидкостями.
- Позволяет проводить оценку эффективности лигандов и антагонистов PAR со средней пропускной способностью.
- Обеспечивает масштабируемость анализа и возможность повторного использования платформы для родственных мишеней GPCR.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям эндотелия, релевантным для конкретных заболеваний, что позволяет исследовать трансляционные биомаркеры.
- Обеспечивает непрерывность процесса от раннего поиска до доклинической валидации противовоспалительных механизмов.
- Поддерживает продвижение молекул-кандидатов с учетом рисков на основе количественных клеточных ответов.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод анализа мобилизации кальция с использованием планшетного ридера связывает этапы раннего поиска и идентификации ведущих соединений для программ, нацеленных на PAR, обеспечивая поддержку как механистических исследований, так и скрининга соединений.
- Биология открытий: Количественная оценка кальциевого сигналинга, индуцированного PAR, для уточнения взаимодействия с мишенью и модуляции сигнального пути.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимые количественные результаты для сортировки соединений и ранжирования их активности.
- Аналитика: Предоставляет данные измерений на основе флуоресценции, позволяющие проводить статистическое сравнение эффективности лигандов и активности антагонистов.
- Трансляционные исследования: Использует модели эндотелиальных клеток, релевантные для контекста тромбовоспалительных заболеваний.
- Применение в масштабах предприятия: Возможность адаптации для других GPCR или мишеней, мобилизующих кальций, для более широкого применения в портфеле разработок.
Операционный и корпоративный эффект
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования при валидации мишеней и способствует более глубокому пониманию механизмов модуляции PAR.
- Операционная ценность: Оптимизирует подготовку и проведение анализа с использованием широко доступного оборудования.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и снижает биологические риски на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию противовоспалительных и тромбовоспалительных кандидатов с учетом оценки рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами клеток и разработки анализов на основе флуоресценции.
- Необходим доступ к стандартным планшетным ридерам с контролем температуры и функцией детектирования флуоресценции.
- Рекомендуется межкомандная стандартизация условий анализа и методов обработки данных.
- Метод может быть адаптирован для других клеточных линий или рецепторных систем, инициирующих мобилизацию кальция.
- Пропускная способность ограничена ручным дозированием и скоростью сканирования планшетного ридера по сравнению с полной автоматизацией.
