Оценка абсолютного, цитозольного, свободного Ca2+ и соответствующей сократимости в изолированных лимфатических сосудах под давлением
22 марта 2024 г.
Этот протокол описывает метод одновременного измерения цитозольного кальция, свободного кальция [Ca2+]i и диаметра сосудов в сужающихся лимфатических сосудах в режиме реального времени, а затем расчета абсолютных концентраций Ca2+ , а также параметров сократимости/ритмичности. Этот протокол может быть использован для изучения Ca2+ и сократительной динамики в различных экспериментальных условиях.
Мы изучаем механизмы сокращения лимфатических сосудов и лимфотока, чтобы лучше понять основную патологию лимфедемы, связанной с раком, а также связь между лимфатической системой и гипертонией. Наша цель состоит в том, чтобы определить терапевтические мишени в лимфатической сосудистой сети, чтобы мы могли разработать новые методы лечения лимфатических заболеваний. Недавние открытия различных анг-каналов в лимфатических мышцах и эндотелиальных клетках, которые вносят свой вклад в основную динамику кальция, сыграли важную роль в продвижении этой области вперед.
Изолированные сосуды и прижизненный микроскоп сыграли решающую роль в изучении функций лимфатических сосудов. В последнее время наблюдается тенденция к использованию «органа на чипе» и микрососудов для исследования многих аспектов биологии лимфатической системы. Очень маленький размер ткани бросает вызов, изучение лимфатической сосудистой сети требует много времени, терпения и разработки новых технологий.
Недоступность маркеров, специфичных для клеток лимфатических мышц, является еще одним препятствием для всего научного сообщества. Преимуществом этого протокола является возможность измерения лимфатических сокращений и абсолютных концентраций кальция в пределах одного сосуда. Это дает дополнительное представление о передаче сигналов кальция, механизмах сокращения, а также возможность измерения исходных сравнений между группами лечения.
По сравнению с другими методами, которые могут основываться на относительных изменениях кальция или парализованных сосудах.
Обзор
В данном протоколе описан метод измерения концентрации цитозольного кальция и диаметра сокращающихся лимфатических сосудов в режиме реального времени. Он позволяет изучать динамику кальция и сократительную способность при различных экспериментальных условиях.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология сосудов
- Кальциевая сигнализация
Теоретические основы
- Понимание сокращений лимфатических сосудов имеет решающее значение для лечения лимфедемы, вызванной раком.
- Недавние открытия в области ионных каналов способствовали развитию лимфатической биологии.
- Такие методы, как использование изолированных сосудов и intravital microscopy, незаменимы при изучении функций лимфатической системы.
- К основным трудностям относятся малый размер тканей и отсутствие специфических маркеров для мышечных клеток лимфатических сосудов.
Цель исследования
- Для идентификации терапевтических мишеней в лимфатических сосудах.
- Для разработки новых методов лечения заболеваний лимфатической системы.
- Для изучения механизмов кальциевой сигнализации и сокращения.
Используемые методы
- Изоляция и канюляция брыжеечных лимфатических сосудов крыс после эвтаназии.
- Измерение диаметра сосудов и концентрации кальция с помощью флуоресцентной микроскопии.
- Использование специфических реагентов для визуализации динамики кальция.
- Применение давления для поддержания физиологических условий в ходе экспериментов.
Основные результаты
- Было достигнуто одновременное измерение концентрации кальция и диаметра сосуда.
- Протокол позволяет проводить сравнение базовых показателей между группами лечения.
- Были получены данные о механизмах сокращения.
- Был продемонстрирован более глубокий анализ механизмов кальциевой сигнализации в лимфатических сосудах.
Выводы
- Данный метод представляет собой надежный подход к изучению функции лимфатических сосудов.
- Он обладает преимуществами перед методами, основанными на анализе относительных изменений уровня кальция.
- Данный протокол может способствовать дальнейшим исследованиям в области биологии лимфатической системы и связанных с ней заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Количественное определение свободного цитозольного Ca2+ и сократимости в изолированных лимфатических сосудах в режиме реального времени позволяет снизить неопределенность при изучении механизмов функционирования лимфатической системы. Этот двухпараметрический подход повышает прогностическую достоверность при валидации мишеней для портфелей исследований заболеваний лимфатической системы и сосудистой биологии. Данный метод обеспечивает надежную основу для оценки фармакологической модуляции сократимости лимфатических сосудов и кальциевой сигнализации в доклинических моделях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую исследовать кальций-зависимые сократительные механизмы в лимфатических сосудах.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем корреляции активности ионных каналов с сократимостью сосудов.
- Способствует механистическому снижению рисков для потенциальных мишеней, влияющих на тонус и кровоток в лимфатической системе.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает валидированные количественные показатели как динамики Ca2+, так и сократительных параметров для разработки анализа.
- Позволяет проводить воспроизводимые сравнения между контрольной группой и группой терапии с использованием абсолютных измерений.
- Поддерживает скрининг фармакологических агентов для изучения их влияния на сократимость лимфатических сосудов и кальциевую сигнализацию.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет доклинические модели с конечными точками лимфатической функции, имеющими значение для заболевания.
- Обеспечивает разработку трансляционных биомаркеров путем установления связи между передачей сигналов Ca2+ и сократительными фенотипами.
- Поддерживает риск-ориентированное продвижение терапевтических средств, нацеленных на лимфатическую систему.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрирован в континуум от этапа поиска до доклинических исследований при разработке лимфатических и сосудистых лекарственных препаратов, обеспечивая поддержку как механистических исследований, так и фармакологического профилирования.
- Открывающая биология: Количественно определяет связь между Ca2+-сигнализацией и сократимостью лимфатических сосудов для проверки гипотез.
- Скрининг: Обеспечивает стандартизированные количественные результаты для оценки соединений и воспроизводимости анализа.
- Аналитика: Предоставляет абсолютные измерения зависимых переменных в режиме реального времени для проведения надежного статистического анализа.
- Трансляционные исследования: Связывает механистические результаты, полученные in vitro, с моделями заболеваний in vivo с помощью функциональных конечных точек.
- Корпоративное повторное использование: Создает универсальную платформу для оценки различных модуляторов функции лимфатической системы.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую уверенность в валидации мишеней и понимании механизмов сократимости лимфатических сосудов.
- Операционная ценность: Стандартизирует измерение ключевых физиологических параметров для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: Обосновывает решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя количественные данные с механистическим обоснованием.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию лимфатических и сосудистых мишеней на ранних этапах разработки с учетом анализа рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области изоляции сосудов, флуоресцентной визуализации и количественного анализа.
- Необходимы специализированные инструменты, включая флуоресцентные микроскопы и программное обеспечение для детектирования границ.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов калибровки и измерения.
- Адаптация метода для других типов сосудов или видов может потребовать оптимизации протокола.
- Малый размер тканей и отсутствие специфических маркеров создают определенные практические сложности для более широкого применения метода.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:53
Setting Up the Perfusion Chamber to Measure Contractility in Isolated, Pressurized Lymph Vessels
2:34
Isolation and Cannulation of Mesenteric Lymph Vessels to Measure Cytosolic, Free Calcium and Vessel Diameter in Contracting Lymph Vessels
4:29
Measurement of the Absolute Concentrations of [Ca2+i2+]i in Isolated, Pressurized Lymph Vessels
