Сборка нуклеосом in situ для одномолекулярной корреляционно-силовой и флуоресцентной микроскопии
6 сентября 2024 г.
В данной статье представлена подробная экспериментальная процедура восстановления нуклеосомных ДНК-тросов для одномолекулярной корреляционной силовой и флуоресцентной микроскопии. Далее описывается несколько последующих экспериментов, которые могут быть проведены для визуализации связывания белков, взаимодействующих с хроматином, и анализа изменений физических свойств нуклеосом.
Методы работы с одиночными молекулами являются мощными инструментами для изучения механики, координации и состава хроматиновых систем. И поэтому исследователи всегда ищут лучшие методы генерации нуклеосомных субстратов. Здесь мы описываем протокол формирования нуклеосом на ДНК в C2 в одномолекулярном корреляционно-силовом и флуоресцентном микроскопе.
Как правило, нуклеосомные субстраты образуются путем сборки нуклеосом на ДНК, содержащей сильные позиционирующие последовательности, с помощью солевого диализа. Хотя у этого есть преимущества, он генерирует искусственно стабильные нуклеосомы и тяжело справляется с реагентами. Наш протокол подготавливает нуклеосомные субстраты для одномолекулярной коррелированной силовой и флуоресцентной микроскопии без специфических последовательностей ДНК и с гораздо меньшим количеством реагентов в течение нескольких минут.
Этот протокол позволяет собирать нуклеосом на нативных последовательностях ДНК, легко регулировать плотность нуклеосом, а также сокращать время подготовки и использования реагентов. Кроме того, образование тросов нуклеосомной ДНК в C2 упрощает экспериментальный рабочий процесс и делает удобным встроенную визуализацию и манипуляции с одной молекулой. Когда равномерное и специфическое позиционирование нуклеосом не является существенной частью эксперимента, наши результаты могут помочь ученым более эффективно изучать хроматин и его добывающие белки на уровне одной молекулы.
Благодаря сэкономленному времени и ресурсам можно провести больше экспериментов для дальнейшего изучения дополнительных переменных и условий. Применимые области исследований, о которых мы сейчас думаем, включают механику хроматина, которая регулируется вариантами гистонов и другими посттрансляционными модификациями. Мы также думаем о биофизических взаимодействиях и кинетике других хроматин-связывающих белков.
И, наконец, мы также думаем о процессах сборки высшего порядка, управляемых нуклеосомами, таких как биомолекулярная конденсация.
Обзор
В данной статье представлен протокол формирования нуклеосом на ДНК in situ для корреляционной одномолекулярной силовой и флуоресцентной микроскопии. Данный метод позволяет осуществлять сборку нуклеосом на нативных последовательностях ДНК с сокращением расхода реагентов и времени подготовки.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биофизика
- Биология хроматина
Теоретические сведения
- Методы анализа единичных молекул имеют важное значение для изучения систем хроматина.
- Традиционные методы сборки нуклеосом могут приводить к созданию искусственно стабильных структур.
- Существует потребность в более эффективных протоколах, минимизирующих расход реагентов.
- В данной работе рассматриваются ограничения существующих методов подготовки нуклеосом.
Цель исследования
- Разработать экспресс-протокол сборки нуклеосом на ДНК.
- Обеспечить возможность визуализации белков, взаимодействующих с хроматином.
- Проанализировать изменения физических свойств нуклеосом.
Используемые методы
- Формирование нуклеосом на ДНК in situ.
- Одномолекулярная корреляционная силовая и флуоресцентная микроскопия.
- Регулирование плотности нуклеосом на нативных последовательностях ДНК.
- Сокращение времени подготовки и расхода реагентов.
Основные результаты
- Данный протокол позволяет эффективно осуществлять сборку нуклеосом без использования специфических последовательностей ДНК.
- Он обеспечивает гибкость в регулировании плотности нуклеосом.
- Значительно меньший расход реагентов по сравнению с традиционными методами.
- Облегчает проведение последующих экспериментов по визуализации поведения белкового связывания.
Выводы
- Данный метод расширяет возможности изучения систем хроматина с помощью методов анализа одиночных молекул.
- Он предлагает более эффективный подход к подготовке нуклеосом.
- Следование данному протоколу позволяет глубже понять динамику хроматина.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для отрасли
Эффективная сборка нуклеосом in situ для одномолекулярной силовой и флуоресцентной микроскопии устраняет ключевое узкое место в исследованиях хроматина, обеспечивая быструю подготовку субстрата с минимальным расходом реагентов. Эта возможность повышает пропускную способность и гибкость исследований на стадии поиска в области механики хроматина, белковых взаимодействий и процессов сборки высшего порядка. Данный метод позволяет с большей уверенностью проводить предварительную валидацию мишеней и снижать риски при изучении механизмов действия терапевтических средств, модифицирующих хроматин.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать взаимосвязь между структурой и функцией хроматина в условиях, близких к нативным.
- Способствует механистическому снижению рисков за счет возможности быстрого тестирования вариантов гистонов и посттрансляционных модификаций.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней для хроматин-связывающих белков и эпигенетических регуляторов.
- Повышает прогностическую достоверность за счет минимизации артефактов, возникающих при искусственном позиционировании нуклеосом.
Скрининг и разработка метода анализа
- Позволяет подготавливать валидированные нуклеосомные субстраты для последующих рабочих процессов скрининга на уровне отдельных молекул.
- Обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость анализа за счет контроля плотности и состава нуклеосом.
- Снижает расход реагентов, что способствует масштабируемой и экономически эффективной разработке методов анализа.
- Облегчает надежную оценку влияния соединений на динамику хроматина и связывание белков.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует состояниям хроматина, имеющим значение для заболевания, за счет возможности сборки на нативных последовательностях ДНК.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа поиска до доклинической валидации вмешательств, направленных на хроматин.
- Позволяет принимать обоснованные решения о дальнейшем развитии проекта с учетом рисков благодаря количественным результатам считывания одиночных молекул.
- Обеспечивает прогностическое снижение рисков при изучении сборки хроматина высшего порядка и биомолекулярной конденсации.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Этот метод сборки in situ объединяет этапы первичного поиска и идентификации ведущих соединений, оптимизируя переход от проверки гипотез к количественному анализу отдельных молекул.
- Фундаментальная биология: ускоряет проверку гипотез о механике хроматина и белковых взаимодействиях при минимальном времени подготовки.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные нуклеосомные субстраты для анализов по скринингу соединений и белков.
- Аналитика: предоставляет данные о зависимости силы от расстояния и показатели флуоресценции для надежного сравнения экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: позволяет достичь соответствия конфигурациям хроматина, имеющим значение для конкретных заболеваний, при использовании нативных матриц ДНК.
- Корпоративное повторное использование: предлагает гибкую и экономичную с точки зрения реагентов платформу, адаптируемую для различных программ исследований хроматина.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность в исследованиях, направленных на хроматин.
- Операционная ценность: стандартизирует сборку нуклеосом, улучшает воспроизводимость и минимизирует расход реагентов.
- Стратегическая ценность: позволяет проводить большее количество экспериментов на единицу ресурса, обеспечивая капиталоэффективное развитие портфеля.
- Влияние на портфель: способствует приоритезации мишеней и модальностей модификации хроматина с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с одномолекулярной силовой и флуоресцентной микроскопией.
- Необходим доступ к оборудованию для оптического захвата и конфокальной визуализации.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов маркировки и определения плотности нуклеосом.
- Метод применим к различным ДНК-матрицам, однако равномерное позиционирование не гарантировано.
- Наиболее подходит для исследований, в которых точное позиционирование нуклеосом не является критически важным.
