Улучшение карт плотности за счет удаления большинства частиц в окончательных стеках криогенной электронной микроскопии с помощью одной частицы
10 мая 2024 г.
Усовершенствованный метод отбора частиц для крио-ЭМ, а именно CryoSieve, улучшает разрешение карты плотности за счет удаления большинства частиц в конечных стопках, что продемонстрировано его применением на реальном наборе данных.
Криогенная электронная микроскопия необходима для определения околоатомных структур биологических макромолекул. Несмотря на то, что он полагается на усреднение многочисленных изображений с низким соотношением сигнал/шум, оптимальное количество частиц, необходимое для определенного разрешения, остается неизвестным. Это ограничение препятствует прогрессу в анализе и методах подготовки образцов.
Чтобы решить эту проблему, мы внедряем метод итерационной сортировки CryoSieve. Стандартный выбор протоколов включает в себя двумерную и трехмерную классификацию, в настоящее время используются другие критерии сортировки протоколов, такие как нормализованный метод взаимной корреляции, подход на основе согласованности углового графа и классификация по невыравниванию. Обширные эксперименты показывают, что CryoSieve превосходит другие алгоритмы сортировки частиц Cryo-EM, показывая, что большинство частиц не нужны в конечных стопках.
Меньшая часть частиц, остающихся в конечных стеках, дает амплитуду с очень высоким разрешением на картах реконструктивной плотности. Для некоторых наборов данных размер самого тонкого подмножества приближается к теоретическому пределу. В cryo-EM подготовка образцов затрудняет рабочий процесс.
Из-за отсутствия стандартных метрик для сравнения протоколов, соотношение выбранных и собранных частиц могло бы служить метрикой качества. Изучение их пространственного и временного распределения также может выявить ключевые физические факторы эффективности подготовки.
Обзор
В данном исследовании представлен CryoSieve — усовершенствованный метод отбора частиц для криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ), который позволяет повысить разрешение карт плотности. Путем удаления лишних частиц из финальных стеков CryoSieve значительно улучшает качество реконструированных карт плотности.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Криоэлектронная микроскопия
- Структурная биология
- Методы отбора частиц
Теоретические основы
- Криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) имеет решающее значение для определения структур биологических макромолекул с почти атомным разрешением.
- Современные методы отбора частиц часто оставляют лишние частицы, что ограничивает разрешение.
- Стандартные методы отбора включают различные способы классификации и метрики.
- Отсутствуют стандартные метрики для сравнения протоколов подготовки образцов.
Цель исследования
- Разработать итеративный метод сортировки для оптимизации отбора частиц в криоэлектронной микроскопии (cryo-EM).
- Продемонстрировать эффективность CryoSieve в повышении разрешения карты плотности.
- Установить метрику качества, основанную на соотношении отобранных частиц к общему числу собранных частиц.
Используемые методы
- Итерационный метод сортировки для отбора частиц.
- GPU-ускорение для повышения эффективности обработки.
- Использование специальных команд для настройки среды и запуска CryoSieve.
- Сравнение карт плотности до и после применения CryoSieve.
Основные результаты
- CryoSieve превзошел существующие алгоритмы отбора частиц.
- Итоговая подгруппа частиц приблизилась к теоретическим пределам, что позволило получить карты высокого разрешения.
- Наблюдалось значительное улучшение B-фактора Розенталя-Хендерсона.
- Улучшенные карты плотности продемонстрировали более четкие боковые цепи и структурные детали.
Выводы
- CryoSieve эффективно повышает качество карт плотности, полученных методом криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ).
- Данный метод позволяет сократить количество частиц при одновременном улучшении разрешения.
- Будущие исследования могут быть сосредоточены на стандартизации метрик подготовки образцов для крио-ЭМ.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Структурное определение биологических макромолекул с высоким разрешением имеет критическое значение для валидации мишеней и снижения механистических рисков в биофармацевтических исследованиях и разработках. Итеративный рабочий процесс отбора частиц CryoSieve повышает качество карты плотности при криоэлектронной микроскопии одиночных частиц путем удаления большинства неинформативных частиц, что напрямую влияет на прогностическую достоверность структурных моделей. Данная возможность способствует принятию более надежных решений на ранних этапах поиска и оптимизации портфеля за счет повышения точности молекулярных данных.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Обеспечивает строгую проверку терапевтических гипотез за счет повышения структурной четкости.
- Снижает механистическую неопределенность путем уточнения карт плотности до почти атомного разрешения.
- Поддерживает функциональную валидацию мишеней, предоставляя более достоверные структурные данные.
- Облегчает приоритизацию портфеля за счет выявления высококачественных мишеней на основе структурных доказательств.
Скрининг и разработка анализа
- Подготавливает валидированные структурные модели для последующего скрининга и процессов оценки соединений.
- Повышает воспроизводимость анализа за счет стандартизации отбора частиц и качества карт.
- Обеспечивает количественную оценку структурных особенностей, имеющих значение для связывания или модуляции лигандов.
- Поддерживает разработку масштабируемой и многократно используемой платформы для скрининга на основе структуры.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет структурные результаты с моделями соответствующих заболеваний для разработки трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает преемственность от этапа поиска до доклинической валидации за счет подтверждения структурной точности.
- Снижает риски при принятии решений о дальнейшем продвижении проекта, предоставляя надежные молекулярные данные высокого разрешения.
- Повышает прогностическую значимость для последующих функциональных и фармакологических исследований.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Рабочий процесс CryoSieve интегрируется в континуум открытий — от ранней структурной биологии до идентификации ведущих соединений и доклинических исследований, обеспечивая итеративную проверку гипотез и уточнение моделей.
- Биология открытий: уточняет структурные гипотезы и проясняет молекулярные пути за счет максимизации разрешения карты плотности.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые высококачественные структурные данные для разработки анализа и скрининга соединений.
- Аналитика: предоставляет количественные показатели, такие как B-фактор и локальное разрешение, для объективного сравнения условий.
- Трансляционные исследования: связывают фазы открытий и доклинических исследований путем сопоставления структурных данных с моделями заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает стандартизированный масштабируемый подход к отбору частиц для нескольких проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неопределенность в структурных моделях.
- Операционная ценность: стандартизирует и оптимизирует отбор частиц, повышая воспроизводимость и масштабируемость.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать более обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет снижения биологических рисков на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: обеспечивает приоритизацию с учетом рисков и продвижение структурно подтвержденных мишеней.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области обработки данных криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) и структурной биологии.
- Необходима вычислительная инфраструктура с GPU-ускорением для эффективной итеративной сортировки.
- Требуется межкомандная стандартизация процесса отбора частиц и метрик качества.
- Метод применим к различным макромолекулярным системам, но зависит от качества набора данных.
- Практические ограничения включают необходимость в надежной подготовке образцов и налаженных рабочих процессах управления данными.
