Диагностика на основе CRISPR в месте оказания медицинской помощи с использованием предварительно смешанных и лиофилизированных реагентов
16 августа 2024 г.
Здесь мы представляем пошаговое приготовление предварительно смешанных, лиофилизированных рекомбиназ на основе изотермической амплификации и кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR), которые могут быть использованы для обнаружения биомаркеров нуклеиновых кислот возбудителей инфекционных заболеваний или других генетических маркеров, представляющих интерес.
Мы разрабатываем тесты на месте оказания медицинской помощи для выявления этих материалов инфекционных заболеваний. В этом тесте используется изотермическая амплификация нуклеиновых кислот и детектирование на основе CRISPR. Обладая высокой осмотической точностью, аналогичной ПЦР, они могут обнаруживать небольшие различия в последовательностях, включая однонуклеотидный полиморфизм, и могут быть множественными.
CRISPR, осмотические реакции содержат множество компонентов и этапов, и их трудно выполнить в месте оказания медицинской помощи. Поскольку осмотики основаны на CRISPR, они очень чувствительны, существует риск переноса загрязнения, что может привести к ложным результатам. К счастью, эту проблему можно смягчить, если мы упростим процедуры реакций.
Мы предлагаем простой в использовании метод выявления возбудителей наших болезней и генетических маркеров с помощью изотермической амплификации рекомбиназы и реагентов на основе CRISPR. Эти реагенты просты в хранении и использовании. Мы также предлагаем советы по устранению распространенных проблем при использовании этих методов и реагентов, чтобы облегчить людям их использование.
В протоколе здесь используются реагенты CRISPR, которые облегчают транспортировку и хранение. Сублимированные реагенты могут быть легко регидратированы в местах использования и сохраняют высокую эффективность амплификации и обнаружения. Мы надеемся применять диагностические технологии CRISPR для выявления эндемических и новых инфекционных заболеваний.
Если этот тест может быть регулярно и правильно выполнен в месте оказания медицинской помощи, это может помочь в выборе противовирусных препаратов и антибиотиков, потенциально спасти жизни, снизить чрезмерное использование лекарств и развитие резистентности.
Обзор
В данной статье представлен метод разработки тестов на месте оказания медицинской помощи, которые используют изотермическое усиление нуклеиновых кислот и CRISPR-базируемное обнаружение для идентификации генетического материала инфекционных заболеваний. Подход направлен на повышение чувствительности и точности при решении таких задач, как риски заражения.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Диагностика инфекционных заболеваний
- Техники амплификации нуклеиновых кислот
- CRISPR технология
Предыстория
- Тестирование на месте оказания медицинской помощи важно для быстрой диагностики инфекционных заболеваний.
- Изотермическая амплификация позволяет эффективно обнаруживать нуклеиновые кислоты.
- CRISPR технология обеспечивает высокую чувствительность для идентификации генетического материала.
- Риски заражения могут привести к ложным результатам в чувствительных анализах.
Цель исследования
- Разработать упрощенную процедуру для CRISPR-базируемых реакций.
- Повысить точность обнаружения небольших генетических вариаций.
- Снижение рисков заражения в условиях оказания медицинской помощи.
Используемые методы
- Приготовление предварительно смешанных, лиофилизированных реагентов для изотермической амплификации.
- Реализация CRISPR-базируемых методов обнаружения.
- Оценка чувствительности и специфичности при обнаружении нуклеиновых маркеров.
- Оптимизация условий реакции для снижения рисков заражения.
Основные результаты
- Разработанный метод продемонстрировал высокую чувствительность для обнаружения генетических маркеров.
- Риски заражения были существенно снижены за счет упрощения процедур.
- Результаты были сопоставимы с традиционными методами ПЦР.
- Подход пригоден для применения на месте оказания медицинской помощи.
Выводы
- Это исследование представляет жизнеспособный метод для быстрого обнаружения возбудителей инфекционных заболеваний.
- CRISPR-базируемые анализы могут быть эффективно упрощены для практического применения.
- Будущая работа может быть направлена на дальнейшее повышение надежности тестов.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Premixed and freeze-dried CRISPR-based diagnostic reagents enable rapid, accurate detection of infectious disease genetic markers at the point of care, addressing operational bottlenecks in decentralized testing. This approach reduces manual handling complexity and contamination risk, supporting scalable deployment in resource-limited and field settings. The method enhances predictive confidence for early intervention and informs therapeutic decision-making in real time.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid interrogation of pathogen genetic markers for target validation in infectious disease research.
- Supports biological de-risking by providing high-sensitivity detection of single nucleotide polymorphisms.
- Facilitates portfolio triage by distinguishing between closely related pathogen strains.
Screening & Assay Development
- Delivers ready-to-use, validated reagent systems for streamlined assay development workflows.
- Improves assay reproducibility and standardization through premixed, lyophilized formats.
- Enables scalable screening of clinical or environmental samples with minimal instrumentation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling detection of disease-relevant nucleic acid signatures.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by providing robust, field-deployable diagnostics.
- Reduces risk in advancing diagnostic candidates by demonstrating stability and efficiency of reagents.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through translational research, supporting workflows from target identification to preclinical validation of diagnostic platforms.
- Discovery Biology: Provides high-confidence detection of genetic targets for hypothesis testing and mechanistic studies.
- Screening: Offers standardized, quantitative outputs for comparing sample conditions and assay performance.
- Analytics: Enables sensitive fluorescence-based readouts for robust data analysis and decision support.
- Translational Research: Bridges laboratory and field applications, supporting biomarker-driven diagnostic development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable reagent platform adaptable to diverse pathogen targets and sample types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in pathogen detection.
- Operational Value: Simplifies workflows, enhances reproducibility, and supports cold-chain independent logistics.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions for diagnostic candidates and reduces late-stage risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of diagnostic assets for emerging and endemic diseases.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid amplification and CRISPR-based assay design.
- Needs access to lyophilization equipment and fluorescence microplate readers for full workflow execution.
- Demands cross-team standardization of reagent preparation and handling protocols.
- Adaptable to various sample types but may require optimization for specific pathogens.
- Stability and efficiency validated for at least eight months at -20°C, supporting extended deployment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:19
Preparation of Lyophilized Reverse Transcriptase‐Recombinase Polymerase Amplification (RT‐RPA) Reactions
5:02
Preparation of Lyophilized CRISPR‐Cas13a Premixed Detection Reagents for Nucleic Acid Biomarkers Detection
7:45
RT‐RPA Nucleic Acid Amplification and CRISPR‐Cas13 Nucleic Acid Detection
