Дифференцировка in vitro наивных CD4+ Т-клеток в патогенные клетки Th17 у мышей
25 октября 2024 г.
Этот протокол описывает дифференцировку наивных CD4+ Т-клеток в патогенные клетки Th17 in vitro. В частности, в сочетании с подходом, основанным на многопараметрической проточной цитометрии, 90% чистота патогенных клеток Th17 может быть получена из наивных CD4+ Т-клеток с использованием этого метода дифференцировки.
Целью нашего исследования является направленная дифференцировка клеток Th17, и мы стремимся изучить простой метод повторной дифференцировки клеток Th17, который служит традиционным условием для повторных экспериментов, связанных с некоторыми заболеваниями клеток Th17. Во многих исследованиях упоминаются методы реинтродукции клеток Th17, а недавние исследования сосредоточены на низкомолекулярных ингибиторах и других стимулах. Тем не менее, чистота внутриутробной индукции почти во всех исследованиях не была стабильной выше 50%Для скрининга и циркуляции клеток Th17 было применено множество новых методов, таких как сортировка клеток Th17 с помощью проточной цитометрии и сортировка магнитных шариков для клеток Th17.
Ключевым моментом является то, что мы нашли простой метод индуцирования дифференцировки клеток Th17 путем добавления различных концентраций в среду, и чистота ее дифференцировки может быть близка к 90%В нашей лаборатории мы изучаем изменения в имино-микроокружении в моделях автостазиса, включая изменение иммунных клеток и направление иммунного дисбаланса, и так далее.
Обзор
В данном протоколе описан метод дифференцировки наивных CD4 + T-клеток в патогенные Th17-клетки in vitro с достижением чистоты 90%. В подходе используется многопараметрическая проточная цитометрия для эффективного анализа клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Клеточная биология
- Патология
Теоретические основы
- Клетки Th17 играют ключевую роль в развитии аутоиммунных заболеваний.
- Традиционные методы индукции дифференцировки Th17 часто характеризуются низкой чистотой получаемой популяции.
- Современные достижения сосредоточены на использовании низкомолекулярных ингибиторов для повышения эффективности дифференцировки.
- Проточная цитометрия является основным методом анализа клеточных популяций.
Цель исследования
- Разработка надежного метода индукции дифференцировки Th17-клеток.
- Достижение высокой чистоты дифференцированных Th17-клеток для исследовательских целей.
- Изучение изменений иммунного микроокружения, связанных с Th17-клетками.
Используемые методы
- Выделение наивных CD4 + T-клеток из селезенки мыши.
- Культивирование T-клеток в специальных средах с использованием коктейлей для активации.
- Проточный цитометрический анализ для оценки дифференцировки клеток.
- Использование магнитной сепарации для обогащения клеточной популяции.
Основные результаты
- 90% наивных CD4 + T-клеток успешно дифференцировались в патогенные Th17-клетки.
- Проточная цитометрия подтвердила высокую чистоту дифференцированных клеток.
- Условия культивирования клеток были оптимизированы для эффективной дифференцировки.
- Наблюдение за изменениями морфологии клеток, указывающими на дифференцировку.
Выводы
- Описанный метод представляет собой простой и эффективный подход к дифференцировке Th17-клеток.
- Высокая чистота популяции Th17-клеток может способствовать дальнейшему изучению аутоиммунных заболеваний.
- Данный протокол может быть адаптирован для различных экспериментальных условий в иммунологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Высокоочищенная дифференцировка патогенных Th17-клеток in vitro устраняет критическое узкое место в поиске лекарственных препаратов для иммунологии, обеспечивая более надежную валидацию мишеней и снижение механистических рисков для программ по лечению аутоиммунных и воспалительных заболеваний. Достижение чистоты дифференцировки приблизительно 90% повышает прогностическую достоверность на этапах раннего скрининга и функциональных исследований, что напрямую влияет на отбор проектов в портфеле и непрерывность трансляционных исследований. Данный протокол повышает надежность релевантных моделей заболеваний для корпоративных конвейеров НИОКР.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Обеспечивает надежный анализ механизмов развития заболеваний, обусловленных Th17-клетками, в контексте аутоиммунных и воспалительных процессов.
- Поддерживает функциональную валидацию мишеней путем получения высокоочищенных популяций Th17-клеток, релевантных данным заболеваниям.
- Способствует снижению механистических рисков и повышает прогностическую достоверность программ на ранних стадиях разработки.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение стандартизированных, воспроизводимых популяций клеток Th17 для последующего скрининга соединений.
- Повышает надежность анализа за счет минимизации клеточной гетерогенности и максимизации эффективности дифференцировки.
- Позволяет количественно оценить влияние соединений на дифференцировку и функцию патогенных Th17.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит модели Th17 in vitro в соответствие с иммунными микроокружениями, характерными для заболевания, для проведения трансляционных исследований.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации за счет получения стабильных клеточных показателей.
- Снижает биологические риски при разработке иммуномодулирующих препаратов-кандидатов, нацеленных на пути Th17.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол дифференцировки является частью процесса от ранних этапов поиска до доклинических исследований, обеспечивая как валидацию мишеней, так и идентификацию ведущих соединений для программ по изучению аутоиммунных и воспалительных заболеваний.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает платформу для проверки гипотез и изучения механизмов патологии, опосредованной Th17.
- Скрининг: Позволяет получать воспроизводимые популяции Th17-клеток высокой чистоты для разработки анализов и оценки соединений.
- Аналитика: Обеспечивает количественные данные проточной цитометрии для сравнения эффективности дифференцировки и функциональных результатов.
- Трансляционные исследования: Позволяет соотнести результаты in vitro с иммунными ответами при соответствующих заболеваниях в доклинических моделях.
- Корпоративное использование: Устанавливает стандартизированный протокол, который может быть адаптирован для нескольких исследовательских программ в области иммунологии.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность в исследованиях, направленных на Th17.
- Операционная ценность: Повышает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость процесса генерации клеток Th17.
- Стратегическая ценность: Повышает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала в иммунологических портфелях.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритезацию с учетом рисков и продвижение кандидатов, модулирующих Th17.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области выделения первичных клеток, магнитной сепарации и анализа методом проточной цитометрии.
- Необходим доступ к инфраструктуре для культивирования клеток и многопараметрическим платформам для проточной цитометрии.
- Требуется межгрупповая стандартизация протоколов дифференцировки и анализа.
- Может потребоваться адаптация для различных линий мышей или моделей заболеваний.
- Степень чистоты и выход могут варьироваться в зависимости от качества исходных клеток и стабильности реагентов.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:38
Isolation and Preparation of Mice Splenic Single‐Cell Suspension for Flow Cytometry Analysis
3:45
Purification and Analysis of Mice Naive CD4+ T‐Cells Using Magnetic Bead‐Based Negative Selection
5:57
In Vitro Induction of Pathogenic Th17 Cells into Naive CD4+ T‐Cells of Mice
