Визуализация и монтаж легких листов для ранних эмбрионов данио-рерио
19 июля 2024 г.
Описана стратегия пробоподготовки для визуализации ранних эмбрионов данио-рерио в интактном хорионе с помощью светового микроскопа. В нем анализируются различные ориентации, которые эмбрионы приобретают в хорионе на 70% стадиях эпиболии и почки, а также подробно описываются стратегии визуализации для получения клеточного разрешения по всему эмбриону с использованием системы световых листов.
Несмотря на внутреннюю асимметрию вдоль лево-правой оси, у большинства высших организмов внешние структуры, такие как скелет и мышцы, развиваются симметрично. Используя эмбрионы рыбок данио, мы сочетаем визуализацию в реальном времени с высоким разрешением, количественный анализ и теоретическое моделирование для изучения принципов установления симметрии. Эта область в значительной степени зависит от различных методов микроскопии для визуализации развивающихся эмбрионов с высоким пространственно-временным разрешением с последующим количественным анализом полученных изображений.
Различные формы микроскопии обеспечивают уникальные преимущества. Тем не менее, в последнее время световая листовая микроскопия и живая микроскопия со сверхвысоким разрешением значительно продвинули наше представление о динамических процессах в эмбриональном развитии. Традиционная конфокальная и многофотонная микроскопия часто приводит к фотообесцвечиванию и фототоксичности, в дополнение к ограниченному полю зрения при визуализации живых эмбрионов.
Многоракурсный световой микроскоп решает эти проблемы, обеспечивая более длительное время наблюдения и вращение образца. Тем не менее, остаются проблемы с подготовкой образцов и монтажом для визуализации с использованием этого метода. Основным ограничением успешного сеанса визуализации является правильная установка и ориентация образца.
В этой статье мы описываем стратегии сбора ранних эмбрионов данио-рерио для визуализации в многоракурсном световом микроскопе, а также общую процедуру получения и реконструкции многоракурсных изображений.
Обзор
В данной статье описывается стратегия подготовки образцов для визуализации ранних эмбрионов zebrafish внутри неповрежденного хориона с помощью плоскостного светового микроскопа. Основное внимание уделяется ориентации эмбрионов на стадиях 70% эпиболии и стадии формирования зачатка, а также излагаются стратегии визуализации для достижения разрешения на клеточном уровне.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология развития
- Методы визуализации
Теоретическое обоснование
- Высшие организмы часто развивают внешние структуры симметрично, несмотря на внутреннюю асимметрию.
- Эмбрионы данио-рерио служат моделью для изучения установления симметрии в процессе развития.
- Живая визуализация с высоким разрешением имеет решающее значение для понимания динамических процессов эмбрионального развития.
- Различные методы микроскопии обладают уникальными преимуществами и ограничениями.
Цель исследования
- Изучить принципы установления симметрии в эмбрионах zebrafish.
- Использовать передовые методы визуализации для более детального наблюдения за развитием эмбрионов.
- Проанализировать ориентацию эмбрионов внутри хориона на критических стадиях развития.
Используемые методы
- Светоsheet-микроскопия для визуализации эмбрионов.
- Количественный анализ полученных изображений.
- Теоретическое моделирование для понимания установления симметрии.
- Сравнение различных методов микроскопии.
Основные результаты
- Микроскопия светового листа обеспечивает разрешение на клеточном уровне при исследовании эмбрионов zebrafish.
- На анализируемых стадиях эмбрионы имеют различную ориентацию внутри хориона.
- Передовые методы визуализации позволяют снизить такие проблемы, как фотовыгорание и фототоксичность.
- Были получены данные о динамических процессах эмбрионального развития.
Выводы
- Данное исследование расширяет понимание симметрии в эмбриональном развитии.
- Микроскопия светового листа является ценным инструментом для визуализации живых эмбрионов в реальном времени.
- Будущие исследования могут опираться на эти результаты для дальнейшего изучения процессов развития.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Мультивидовая микроскопия светового листа позволяет получать изображения ранних эмбрионов zebrafish с высоким разрешением и низкой фототоксичностью, что способствует надежному количественному анализу процессов развития. Оптимизированные стратегии монтирования и визуализации имеют решающее значение для создания воспроизводимых наборов данных клеточного масштаба, необходимых для раннего поиска и валидации мишеней. Эти возможности повышают прогностическую достоверность моделей биологии развития, применимых в рамках научно-исследовательских циклов биофармацевтических разработок.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет проводить количественный анализ путей развития на живой модели позвоночных.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней за счет визуализации динамических клеточных событий в режиме реального времени.
- Способствует снижению рисков при изучении механизмов за счет высококонтентного имиджинга процессов установления симметрии и морфогенеза.
Скрининг и разработка методов анализа
- Обеспечивает стандартизированные протоколы монтирования и визуализации для воспроизводимой разработки анализа.
- Предоставляет количественные наборы данных под разными углами, подходящие для последующего анализа изображений и фенотипического скрининга.
- Повышает масштабируемость анализа за счет минимизации фототоксичности и максимального увеличения продолжительности визуализации.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет результаты визуализации с соответствующими патологическими процессами развития в моделях позвоночных.
- Обеспечивает непрерывность перехода от ранних открытий к доклинической валидации за счет поддержки лонгитюдных исследований эмбрионального развития.
- Снижает трансляционные риски, предоставляя данные о морфогенетических механизмах на клеточном уровне.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Микроскопия световым занавесом с оптимизированным методом крепления образцов встраивается в непрерывный процесс исследований: от первоначальной проверки гипотез до валидации на доклинических моделях.
- Биология открытий: обеспечивает анализ динамики путей и симметрии развития на основе выдвинутых гипотез.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые количественные результаты визуализации для сравнительного анализа в различных условиях.
- Аналитика: позволяет получать наборы данных с клеточным разрешением под разными углами для надежной статистической оценки.
- Трансляционные исследования: дает понимание механизмов, необходимых для выбора доклинических моделей и согласования биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает стандартизированный рабочий процесс визуализации, адаптируемый к различным моделям развития и заболеваний.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов и снижает неопределенность при валидации терапевтических мишеней в процессе разработки.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и стандартизацию анализов на основе методов визуализации.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает обоснованность принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет получения высококонтентных количественных данных на ранних этапах пайплайна.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию мишеней и моделей с учетом рисков на основе надежных данных визуализации.
Особенности реализации
- Для оптимальной подготовки образцов требуются экспертные знания в области прижизненной визуализации и эмбриологии Danio rerio.
- Необходим доступ к платформам многовидовой светоsheet-микроскопии и современным инструментам анализа изображений.
- Для обеспечения воспроизводимости требуется межкомандная стандартизация протоколов монтажа и визуализации.
- Может потребоваться адаптация стратегий монтажа для различных стадий развития или модельных систем.
- Необходимо учитывать ограничения поля зрения при визуализации для обеспечения разрешения на клеточном уровне во всех образцах.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:37
Sample Preparation for Imaging Early Zebrafish Embryos Within an Intact Chorion Using a Light‐Sheet Microscope
2:53
Analyzing Different Orientations of Zebrafish Embryos Within the Chorion Using Multiview Imaging
4:53
Multiview Image Analysis to Obtain Cellular-Scale Resolution Throughout the Embryo
