Анализ in vitro для изучения миграции тромбоцитов с использованием функционализированных РГД авидин-биотиновых тротов

Тромбоциты имеют решающее значение для предотвращения потери крови после повреждения сосудов, борьбы с инфекциями и поддержания целостности сосудов во время воспаления. В то время как гемостатические пробки требуют коллективной активации и агрегации тромбоцитов, их роль в защите воспаленных кровеносных сосудов выполняется на уровне отдельных клеток. В этом контексте недавние исследования показали, что тромбоциты могут мигрировать автономно, что зависит от механоощущения их адгезивного микроокружения.

Этот подход позволяет точно контролировать адгезивные свойства субстрата и служит простым анализом in vitro для изучения механизмов, лежащих в основе миграции тромбоцитов. Результаты показывают, что мигрирующие тромбоциты, связывающиеся с интегриновыми лигандами, могут оказывать действие, способное нарушить связь авидин-биотин. Этот анализ обеспечивает простой и надежный метод визуализации миграции тромбоцитов.

В сочетании с визуализацией живых клеток это поможет нам лучше понять взаимодействие и регуляцию различных компонентов цитоскелета в этой важной функции тромбоцитов. Для начала обработайте стеклянную крышку ультразвуком в 20% азотной кислоты на одну минуту, а затем обработайте ультразвуком изопропанол, этанол и воду в течение одной минуты. Предварительно очищенные покровные стекла обработайте кислородной плазмой в плазмочистителе в течение двух минут, затем соберите их липкими предметными стеклами.

Теперь заполните канал 2,5 микролитрами PLL-PEG-биотина, разведенного в 97,5 микролитрах PLL-PEG и выдержите 30 минут при комнатной температуре, затем трижды промойте PBS. Далее добавьте 100 микролитров нейтравидина-FITC и выдержите 30 минут в темноте при комнатной температуре, после чего трижды промыть PBS. Наконец, добавьте 100 микролитров биотина цикло-РГД, выдержите 30 минут при комнатной температуре и трижды промойте PBS.

После обезболивания мыши и удаления кожи грудной клетки введите иглу между вторым и третьим ребрами с левой стороны грудины, чтобы взять кровь из сердца. Смешайте кровь с одним миллилитром буфера Тироде и центрифугируйте при 70 г в течение 20 минут при комнатной температуре при выключенном тормозе, затем возьмите верхнюю часть, содержащую обогащенную тромбоцитами плазму. Смешайте с тремя миллилитрами буфера Tyrode и добавьте 100 нанограмм на миллилитр простациклина, чтобы предотвратить активацию тромбоцитов.

После этого центрифугируйте при 1200 г в течение пяти минут при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах буфера Tyrode. Затем с помощью гемоцитометра измеряют количество тромбоцитов.

Для начала возьмите тромбоциты мышей в каналы покрытия cRGD биотин-нейтравидин-биотин и зарегистрируйте живую миграцию тромбоцитов с помощью инвертированного микроскопа, оснащенного сценическим инкубатором. Чтобы подсчитать количество адгезии или миграции тромбоцитов, щелкните правой кнопкой мыши выпадающее меню точечного инструмента на панели инструментов и выберите многоточечный инструмент. Извлеките расстояние миграции из неподвижных образцов путем измерения длины пути миграции, отпечатанной в покрытии нейтравидин-FITC.

Щелкните правой кнопкой мыши по выпадающему меню инструмента прямой линии на панели инструментов и выберите бесплатный инструмент для работы по линии руки. Чтобы количественно оценить форму тромбоцитов, выберите «Изображение», «Настройка» и «Порог» на панели инструментов, чтобы создать бинарные маски путем сегментации флуоресцентных тромбоцитов. Выберите дескрипторы формы в меню «Анализ и задание измерений», затем выберите «Отобразить результаты с помощью функций «Анализ и анализ частиц».

Тромбоциты демонстрировали оптимальную миграцию при концентрации 2,5% PLL-ПЭГ-биотина. Миграция была снижена как при более низкой, так и при более высокой плотности лигандов. Тромбоциты распространяются неадекватно при плотности лиганда 1%, о чем свидетельствует низкая площадь и периметр, что указывает на недостаточную активацию интегринов.

При плотности лиганда 2,5% тромбоциты эффективно распространяются, разрушая лиганды cRGD и мигрируя. Высокая плотность лигандов приводила к распространению тромбоцитов без поляризации, уменьшая миграцию из-за неспособности разорвать лиганды cRGD.