Количественная оценка цитокин-индуцированной гибели клеток в органоидах толстой кишки человека с помощью живой флуоресцентной микроскопии
August 2nd, 2024
Этот протокол описывает простой и экономически эффективный метод исследования и количественной оценки гибели клеток в органоидах толстой кишки человека в ответ на цитотоксические пертурбагены, такие как цитокины. В этом подходе используется флуоресцентный клеточный смертельный краситель (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), живая флуоресцентная микроскопия и программное обеспечение для анализа изображений с открытым исходным кодом для количественной оценки реакций отдельных органоидов на цитотоксические стимулы.
Воспалительные цитокины интерферон-гамма и ФНО существуют уже сотни миллионов лет и имеют решающее значение для эффективной защиты хозяина от межклеточных патогенов. Наша исследовательская группа пытается понять, как эти цитокины убивают клетки, такие как эпителиальные клетки кишечника и раковые клетки. Обычно используемые системы для изучения механизмов гибели эпителиальных клеток кишечника включают мышиные модели и иммортализированные линии раковых клеток.
Испытуемые органоиды человека имеют преимущество, поскольку они генерируются непосредственно из биопсии пациента и сохраняют многие физиологические и морфологические характеристики исходной ткани. Это означает, что они имеют повышенную трансляционную ценность. Исследования органов имеют проблемы с воспроизводимостью экспериментов и имеют ряд технических проблем по сравнению с традиционными клеточными культурами.
Современные методы измерения гибели органоидных клеток также имеют ограничения. Некоторые из них являются лишь полуколичественными, не измеряют гибель клеток напрямую, не могут измерить одиночные органоидные реакции или требуют дорогостоящего оборудования и сложных протоколов. Наш протокол количественного анализа гибели органоидных клеток прост, надежен и недорог.
Мы использовали наш протокол для измерения одиночных органоидных реакций на цитотоксические комбинации цитокинов, но он может быть легко адаптирован для изучения любого типа возмущений. Этот метод полезен для исследований клеточной гибели, функции эпителиального барьера или иммунологии слизистых оболочек. Недавно мы сообщили, что интерферон-гамма и ФНО-синергия вызывают гибель воспалительных клеток в эпителиальных клетках кишечника и раковых клетках толстой кишки.
Они делают это через сигнальный путь JAK1/2-STAT1. В будущей работе мы хотим понять, о каком типе клеточной смерти идет речь и как JAK1 и JAK2 убивают клетки.
Обзор
Это исследование исследует механизмы клеточной смерти в человеческих колониальных органоидах в ответ на воспалительные цитокины, такие как интерферон гамма и TNF альфа. Используя новый протокол с флуоресцентными красителями и микроскопией в реальном времени, исследование предоставляет надежный метод для количественной оценки клеточной смерти на уровне одного органоида.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Механизмы клеточной смерти в эпителиальных клетках
- Воспаление в тканях кишечника
- Трансляционные исследования с использованием органоидов, полученных от человека
Предыстория
- Важность воспалительных цитокинов в защитных реакциях организма
- Ограничения традиционных экспериментальных систем для изучения клеточной смерти
- Преимущества использования органоидов, полученных от пациентов, для воспроизводимости эксперимента
Используемые методы
- Количественный анализ цитотоксических реакций в органоидах
- Человеческие колониальные органоиды, полученные от пациентов
- Флуоресцентные анализы клеточной смерти и методы анализа изображений
Основные результаты
- Демонстрирует синергический эффект цитокинов при индуцировании клеточной смерти
- Количественно оценивает реакции отдельных органоидов на лечение
- Определяет сигнальные пути, участвующие в клеточной смерти, индуцированной цитокинами
Выводы
- Протокол улучшает понимание клеточной смерти эпителиальных клеток при воспалительных состояниях
- Этот метод может послужить основой для будущих исследований по иммунологии слизистых оболочек и терапевтических вмешательств
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of cytokine-induced cell death in patient-derived human colonic organoids addresses a critical gap in translational IBD research by enabling robust, reproducible measurement of epithelial barrier disruption. This workflow enhances predictive confidence for target validation and mechanistic de-risking at the intersection of discovery biology and preclinical modeling. The approach supports portfolio decisions by clarifying cytokine synergy and cytotoxicity in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cytokine-driven cell death mechanisms in human-derived organoids.
- Supports functional target validation by quantifying single-organoid responses to perturbagens.
- Facilitates mechanistic de-risking through CPI-based analysis of cytokine interactions.
- Improves predictive confidence for advancing targets implicated in epithelial barrier dysfunction.
Screening & Assay Development
- Establishes a standardized, quantitative assay for cytotoxicity in organoid models.
- Delivers reproducible, scalable outputs suitable for compound or cytokine screening.
- Enables robust measurement of additive, synergistic, or antagonistic effects using CPI calculations.
- Prepares validated biological systems for downstream screening and mechanistic studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant patient-derived models for translational continuity.
- Supports biomarker development by quantifying cell death in response to IBD-relevant cytokines.
- Reduces translational risk by modeling human epithelial responses to inflammatory stimuli.
- Enables risk-adjusted advancement of therapeutic hypotheses targeting mucosal immunology.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol bridges early discovery and preclinical research by providing a quantitative, reproducible workflow for assessing cytokine cytotoxicity in human organoids.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for cytokine-induced cell death.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs for evaluating perturbagen effects.
- Analytics: Provides normalized, statistically robust measurements and CPI-based interaction analysis.
- Translational Research: Ensures disease relevance by using patient-derived organoids and clinically relevant cytokines.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, adaptable platform for diverse cell death and barrier function studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes cell death quantification and enhances reproducibility across studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation by clarifying cytokine interactions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and therapeutic strategies in IBD and mucosal immunology.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organoid culture, live fluorescence microscopy, and image analysis.
- Needs access to digital inverted epifluorescence microscopy and open-source analysis software.
- Demands cross-team standardization for assay setup, imaging, and data normalization.
- Adaptable to various perturbagens and patient-derived organoid systems with protocol optimization.
- Potential limitations include technical variability in organoid preparation and imaging consistency.
