Посмертная диагностика бешенства у животных с помощью обновленного мультиплексного анализа полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией LN34 в реальном времени

Бешенство на сто процентов смертельно, и для получения жизненно важного лечения необходим быстрый, точный диагноз. Надёжное лабораторное тестирование крайне важно для контроля бешенства. CDC разработал пошаговый протокол тестирования на бешенство с помощью количественной обратной транскриптазы ПЦР или RT-PCR, используя валидированный тест на вирус Alisa в реальном времени под названием LN34, что позволяет лабораториям повышать точность диагностики и поддерживать меры по профилактике бешенства.

Десятилетиями тестирование на бешенство основывалось на прямых флуоресцентных антителах, называемых DFA или FAT. Однако многие международные лаборатории также используют RT-PCR для тестирования на бешенство благодаря его высокой чувствительности и точности. Тест DFA на бешенство требует специализированных микроскопов, хранения холодной цепи, специализированного обучения персонала, а реагенты в последние годы испытывают дефицит; ПЦР и RT-PCR сейчас широко используются для тестирования патогенов.

Многие лаборатории уже оснащены оборудованием и экспертизой для ПЦР и RT-PCR, а необходимые реагенты доступны у коммерческих поставщиков. Стоимость — серьёзный барьер для тестирования на бешенство в районах с наибольшим числом случаев бешенства у людей. CDC разработала мультиплексную версию анализа LN34, которая улучшает контроль качества и снижает стоимость тестируемого образца.

RT-PCR всё чаще внедряется для диагностики бешенства, поскольку она широко применяется для тестирования других патогенов, а результаты легко интерпретироваться. Но использование валидированного теста крайне важно, и убедиться, что тест работает как ожидается, не менее критично. Наш пошаговый протокол включает контроль качества, вопросы безопасности и лучшие практики ПЦР, чтобы помочь лабораториям начать работу.

Для начала наденьте средства индивидуальной защиты, включая очки, закрытую переднюю платье и две пары перчаток. Очистите и продезинфицируйте рабочую поверхность четвертичным аммиаком, либо другим подходящим дезинфицирующим средством для инактивации вируса бешенства. Разложите пластиковую абсорбирающую подложку на рабочую поверхность, используя чистый одноразовый скальпель для сбора ткани, представляющий полный срез ствола мозга и мозжечка.

Для гомогенизации и экстракции РНК, наконец, измельчите необходимые ткани с помощью одноразового скальпеля. Размазывайте ткань мазком и перенесите мазок в пробирку, заполненную буфером для гомогенизации и бусинами. После удаления внешней перчатки с помощью дезинфицирующего средства QAC 1:256 очистите и продезинфицируйте рабочее место, оборудование и снаружи пробирки пробирки.

Гомогенизируйте образцы с помощью мини-бисера в течение 60 секунд. И визуально осмотреть трубки. Дайте образцам постоять пять минут при комнатной температуре.

Наконец, очистите и продезинфицируйте рабочее место, оборудование и снаружи пробирки с помощью дезинфицирующего средства QAC перед удалением РНК. Для начала проведите поверхностную дезактивацию биологического защитного шкафа с использованием QAC, разбавленной до 1:256. Проведите дополнительную чистку для удаления пыли или других загрязнителей окружающей среды.

Положите на рабочую платформу пластиковую абсорбирающую площадку. Затем разместите реагенты и образцы в шкафу для биобезопасности. Разложите все трубки для сбора в чистой полке для микроцентрифуг.

Заранее заполните одну микроцентрифугную пробирку объемом 1,5 миллилитра 300 микролитрами 100%этанола для каждого образца мозга. Центрифугуйте гомогенизированные образцы мозга при 10 000–16 000 G в течение двух минут в настольной микроцентрифугах. Переместите прозрачный розовый супернатант в новую стерильную трубку с 100% этанолом, протяните пипетку вверх и вниз, чтобы перемешать и перевести 600 микролитров этаноловой супернатантной смеси в спин-колонку в сборной трубке.

Центрифугуйте одну минуту, пока жидкость не пройдёт через колонку, сбросьте поток и перенесите каждую колонку в новую сборную трубку. Добавьте 400 микролитров буфера предварительной промывки РНК в каждую колонку. Центрифугуйте смесь при температуре 10 000–16 000 G в течение 30 секунд и выпустите поток.

Верните каждую колонку в одну и ту же трубку для сбора и повторите этап предварительной промывки во второй раз. Далее добавьте 700 микролитров буфера для промывания РНК в каждую колонку. Центрифугу при 10 000–16 000 G в течение двух минут.

И аккуратно переложите их в трубку без РНаз. Сбросьте поток и трубку для сбора трубки, затем снимите и выбросьте внешние перчатки. Теперь добавьте 50 микролитров воды без ДНКазы и РНазы непосредственно в матрицу колонки и инкубуйте 30 секунд.

Затем центрифугуйте при 10 000–16 000 G в течение одной минуты. Аккуратно перенесите РНК в новый винтовый верхний плоский приём с маркировкой микроцентрифугной трубки для RT-PCR анализа. Для начала разморозьте одноступенчатый буфер RT-PCR, без контроля шаблона, воду без нуклеаз, праймеры и зонды на льду в пространстве подготовки мастер-смеси.

Поместите фермент RT-PCR с одним шагом на лёд. Вычислите объём каждого реагента для мультиплексированных и бета-A мастер-миксов LN34. Обозначить скважины для каждого образца в тройном экземпляре для мультиплексированного анализа LN34 с использованием карты пластин на 96 лунц.

После вихря и вращения в каждую назначенную скважину LN34 нанесите 23 микролитра мастер-смеси мультиплекса LN34. Для установления отрицательных шаблонных контрольных реакций добавьте два микролитра воды ПЦР-класса в каждую отрицательную контрольную скважину. Поставьте пластину из 96 колодец на лёд.

Очистите рабочее место 70% этанолом. Теперь в рабочем пространстве шаблонного издания размораживайте образцы РНК и положительный контрольный одноразовый аликвот искусственной РНК на льду. После вихря кратковременно центрифугировать пробирки с образцами РНК пипеткой два микролитра образца или положительной контрольной РНК в соответствующую яму.

После добавления всех образцов наместите оптическую клеевую крышку на колодцы, чтобы полностью их герметизировать. Центрифугуйте пластину при 500 G в течение одной минуты при комнатной температуре, затем поместите запечатанную пластину в прибор реального времени или количественный ПЦР, откалиброванный для репортёров FAM и VIC Hex репортёров. Установите инструмент на соответствующие параметры циклирования.

После завершения запуска установите пороговые значения на 0,2 для LN34 и 0,05 для бета-актина. Проверьте кривые контрольных образцов на наличие проблем с качеством. Анализ LN34 показал успешные кривые амплификации, при этом положительные результаты пересекли порог при различных значениях порога цикла при логарифмической шкале.

И сигмоидные кривые амплификации на линейном уровне как для LN34, так и для бета-актина. Отрицательные результаты показывали плоские линии без усиления. Были выявлены аномальные кривые амплификации, при этом некоторые демонстрировали линейные, а не сигмоидальные увеличения флуоресценции, что указывает на нетипичные результаты.

Соответствующие многокомпонентные графики показывали неправильные волнистые флуоресцентные сигналы вместо ожидаемых гладких кривых. Это подчеркнуло необходимость анализа графиков усиления, а не опираться исключительно на значения порога цикла.