Измерение митохондриального дыхания в скелетных мышечных волокнах человека и мыши с помощью респирометрии высокого разрешения
4 октября 2024 г.
В данной статье мы описываем комплексный метод измерения митохондриального окислительного фосфорилирования в свежих пермеабилизированных скелетных мышечных волокнах из мышц человека или мыши. Этот метод позволяет количественно оценивать митохондриальное дыхание в режиме реального времени и оценивать топливные предпочтения и метаболическую гибкость при сохранении существующих митохондриальных сетей и целостности мембран.
Наше исследование сосредоточено на пересечении метаболизма и реакций на стресс при метаболических заболеваниях, что является основной темой программы NORD Вашингтонского университета. Благодаря синергизму между нашими ядрами NORD мы можем решать сложные вопросы в области пищевого метаболизма и заболеваний с помощью междисциплинарного и совместного подхода. С помощью традиционных анализов митохондриального дыхания исследуются изолированные митохондрии.
Изоляция митохондрий занимает много времени и может нарушить целостность внешней митохондриальной мембраны. Кроме того, митохондрии не функционируют в одиночку, а являются частью динамической сети клеточной метаболической адаптации. Наш протокол поддерживает эту сеть, чтобы обеспечить физиологически значимую оценку функции митохондрий.
Мы сосредоточились на выявлении регуляторов метаболической адаптации, которые важны для здоровья и болезней. Ключевые вопросы, которые мы задаем, включают в себя: одинаково ли важны эти регуляторы, такие как протеаза сайта 1, для разных типов тканей? И каково их физиологическое значение?
Обзор
В данном исследовании представлен подробный протокол измерения митохондриального окислительного фосфорилирования в свежих пермеабилизированных волокнах скелетных мышц человека или мыши. Этот метод позволяет в режиме реального времени количественно оценивать митохондриальное дыхание, предпочтение субстратов и метаболическую гибкость, сохраняя при этом структуру митохондриальных сетей и целостность мембран.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Метаболические заболевания
- Митохондриальная функция
- Метаболизм и стрессовые реакции
Теоретическая база
- Современные методы часто предполагают выделение митохондрий, что создает риск нарушения целостности мембран.
- Митохондрии функционируют в рамках динамической клеточной сети.
- Понимание митохондриального дыхания имеет решающее значение для лечения метаболических заболеваний.
Используемые методы
- Респирометрия высокого разрешения
- Волокна скелетных мышц мышей и человека
- Измерения потока кислорода в реальном времени для различных субстратов
Основные результаты
- Обеспечена физиологически релевантная оценка митохондриальной функции.
- Продемонстрирована возможность оценки метаболической гибкости.
- Определена роль метаболических регуляторов в различных типах тканей.
Выводы
- Данный метод углубляет понимание митохондриального метаболизма в норме и при патологии.
- Он способствует исследованию метаболических заболеваний и механизмов адаптации к стрессу.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Респирометрия высокого разрешения в пермеабилизированных волокнах скелетных мышц позволяет осуществлять точные и физиологически значимые измерения митохондриального окислительного фосфорилирования, которое является критическим фактором клеточного энергетического обмена. Этот подход способствует раннему поиску и валидации мишеней для портфелей препаратов против метаболических заболеваний, предоставляя надежные количественные данные о функции митохондрий и метаболической гибкости. Интеграция этих измерений повышает прогностическую уверенность в ключевых точках принятия решений в рамках программ исследований и разработок (R&D) в области метаболического здоровья и здоровья мышц.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать митохондриальную биоэнергетику и метаболическую адаптацию в мышечной ткани при различных заболеваниях.
- Способствует снижению биологических рисков за счет сохранения митохондриальных сетей и целостности мембран в ходе функциональной оценки.
- Облегчает функциональную валидацию мишеней для регуляторов метаболической настройки в различных типах тканей.
- Предоставляет количественные данные для повышения прогностической достоверности и приоритизации портфеля исследований метаболических заболеваний.
Скрининг и разработка анализа
- Подготавливает валидированные системы мышечных волокон для последующего скрининга соединений и изучения механизмов действия.
- Обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые измерения потребления кислорода для разработки анализа.
- Позволяет оценивать субстрат-специфическое дыхание, что способствует скринингу метаболических модуляторов.
- Поддерживает масштабируемость и повторное использование платформы для моделей человека и грызунов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет показатели митохондриальной функции с конечными точками, имеющими значение для патологии при метаболических и мышечных заболеваниях.
- Обеспечивает преемственность от этапа первичного поиска до доклинической валидации за счет использования физиологически сохранных мышечных волокон.
- Предоставляет скорректированные с учетом рисков данные для принятия решений о продвижении программ по изучению метаболического здоровья и здоровья мышц.
- Повышает точность прогнозирования рисков путем количественного определения метаболической гибкости и предпочтений в источнике энергии в соответствующих моделях.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол респирометрии высокого разрешения связывает этапы предварительного поиска, идентификации перспективных соединений и доклинических исследований, обеспечивая надежную оценку функции митохондрий в мышечных волокнах человека и мыши.
- Фундаментальная биология: Поддерживает проверку гипотез и уточнение путей метаболической адаптации и митохондриальной регуляции.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимые количественные показатели потока кислорода для подготовки анализов и оценки соединений.
- Аналитика: Предоставляет данные о дыхании в режиме реального времени с привязкой к конкретным субстратам для сравнения метаболических состояний и воздействий.
- Трансляционные исследования: Сохраняет физиологическую релевантность для согласования биомаркеров и моделирования заболеваний.
- Корпоративное использование: Предлагает стандартизированную межвидовую платформу для многократного применения в исследованиях метаболизма и здоровья мышц.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую уверенность и снижает механистическую неопределенность в исследованиях митохондрий и метаболизма.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость анализов митохондриальной функции.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и эффективность использования капитала за счет предоставления надежных функциональных данных на ранних этапах разработки.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию с учетом рисков и продвигать программы по изучению здоровья мышц и метаболизма.
Особенности реализации
- Требуется опыт в изоляции мышечных волокон и работе с приборами для респирометрии высокого разрешения.
- Необходим доступ к специализированному оборудованию и аналитическому программному обеспечению для измерения потока кислорода.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов подготовки образцов и нормализации данных.
- Метод применим как к мышечным волокнам человека, так и грызунов, что отвечает потребностям трансляционных исследований.
- Правильная подготовка образцов имеет решающее значение для сохранения целостности митохондриальных мембран и достоверности данных.
