Веб-рабочий процесс для выбора ген- и тканеспецифических энхансеров

Мы заинтересованы в расшифровке некодирующего генома, чтобы понять, как регулируются гены, чтобы они экспрессировались в нужное время и в нужном месте. Мы разрабатываем удобные для пользователя протоколы с использованием веб-инструментов геномики, чтобы сделать расширенные открытия доступными для всех биологов. Широкая доступность мультимодальных данных, которые могут помочь сузить круг расположения энгенсеров и облегчить доступ к этим данным через веб-интерфейсы с открытым исходным кодом.

Это позволяет проводить комплексную идентификацию энхансеров, не требуя от исследователей знаний в области программирования. Этот протокол обеспечивает основу для любого, кто не имеет опыта в биологии энхансеров, чтобы начать навигацию по общедоступным наборам данных для извлечения энхансеров для интересующих генов. В качестве примера мы используем TBX5, известного игрока в области биологии сердца.

Наш рабочий процесс выявил 21 энхансер, которые могут пролить свет на механизмы развития сердца и врожденные пороки сердца. Мы расширим наш протокол новыми источниками данных, в том числе пространственной геномикой, и разработаем дополнительные удобные инструменты для биологов. Для начала откройте браузер генома Ensembl.

Выберите сборку генома, которая соответствует интересующему виду и версии. Введите интересующий вас ген в поле поиска и нажмите «Перейти».Из результатов нажмите на соответствующий идентификатор гена Ensembl.Затем прокрутите до раздела «Сводка» и нажмите на ссылку «Область в деталях», чтобы визуализировать окружающую область интересующего гена. Теперь найдите два гена, расположенных по бокам от интересующего гена, используя трек Gene Legend.

Эти гены отображаются в виде визуальных элементов, представляющих объединенные аннотации Ensembl и Havana в рамках основных аннотаций генов из трека GENCODE. Определите направленность интересующего гена, наблюдая за признаками «больше» или «меньше» рядом с названиями генов. Щелкните и перетащите курсор через межгенную область между этими генами, затем нажмите «Перейти к области» во всплывающем окне, чтобы просмотреть выбранную область.

Настройте отображение, нажав «Добавить» или «Удалить треки» в верхней части просмотрщика треков. Используйте элементы управления масштабированием и навигацией для настройки вида для улучшенной визуализации региона. В окне просмотра вкладки «Регион в деталях» нажмите «Настроить эту страницу» на боковой панели.

На боковой панели «Настроить изображение области» в разделе «Регулирование» выберите «Активность по клеткам или тканям». Используйте строку поиска клеток или тканей, чтобы найти и выбрать нужные ткани, или используйте буквенный индекс под строкой. Нажмите на вкладку «Эксперименты» рядом с опцией «Клетка или ткань».

Выберите H3K4me1 и H3K27ac в качестве маркера для усилителей и H3K4me3 в качестве маркера для промоутеров и нажмите «Настроить отображение трека». Затем выберите «Просмотреть треки», чтобы визуализировать области, помеченные H3K4me1 в области обнаружения энхансера, и области, помеченные H3K4me3 выше интересующего гена. Щелкните по цветным визуальным элементам или элементам прямоугольника в треке H3K4me1, чтобы получить геномные координаты областей, отмеченных в пределах определенной области обнаружения.

Откроется всплывающее окно Hists and Pols, в котором отображается расположение генома элемента в парах оснований. В качестве альтернативы можно вручную определить области интереса для каждого геномного признака, щелкнув и перетащив дорожку, чтобы поместить пики графика под дорожки H3K4me1 или H3K27ac. Затем скопируйте координаты местоположения генома в текстовый файл и сохраните файл в формате BED.

Получите доступ к порталу данных 4DN. На главной странице убедитесь, что «Наборы экспериментов» выбрано в качестве оси Y основного полосного столбца, «Тип эксперимента» выбрано в качестве оси X, а график сгруппирован по организмам. Найдите панель In Situ Hi-C вдоль оси X и нажмите на часть, представляющую наборы для экспериментов на людях.

Во всплывающем окне нажмите кнопку «Обзор» и выберите миобласты сердечной мышцы и интересующий нас ген TBX5, связанный с органогенезом сердца. Нажмите на ссылку в столбце «Заголовок» соответствующего биообразца, соответствующего интересующей ткани. Затем на вкладке «Обработанные файлы» нажмите «Исследовать данные», чтобы изучить набор данных Hi-C более подробно.

Введите координаты идентифицированного промотора в интересующей ткани и щелкните правой кнопкой мыши тепловую карту, чтобы отметить область горизонтально. Эти линии позволяют визуально отслеживать область промотора на тепловой карте. При необходимости настройте вид, перетаскивая его по вертикали до тех пор, пока верхняя и нижняя границы в координатах Y строки поиска не совпадут с границами интересующей области.

Чтобы удалить ненужные линии, щелкните линию правой кнопкой мыши и выберите «Горизонтальное» или «Вертикальное правило», затем нажмите «Закрыть ряд». Введите координаты всех экспериментально проверенных усилителей управления, чтобы рассчитать порог взаимодействия на основе их минимальных значений взаимодействия. Отобразите три усилителя контроля из литературы вместе с областью промотора из Ensembl с помощью предварительно подготовленного вида.

Затем определите пороговое значение усилителя промотора с помощью этих усилителей управления, выбрав наименьшую ненулевую оценку взаимодействия, обозначенную цветовым ключом в правой части матрицы тепловой карты. Введите геномные координаты всех областей энхансера, связанных с H3K4me1, и отметьте их вертикально на тепловой карте Hi-C. Отфильтруйте слабо взаимодействующие области, сравнив оценки взаимодействия областей, помеченных H3K4me3, с порогом взаимодействия.

Выберите геномные координаты, показывающие частоты взаимодействия выше этого порога, которые отображаются на тепловой карте в виде более концентрированных или более темных сигналов, и сохраните их в формате BED. Три из четырех сердечных усилителей, идентифицированных в браузере VISTA Cardiac Enhancer Browser, HS2329, mm1282 и mm370, перекрывались с областями, предсказанными веб-протоколом обнаружения энхансеров. Усилитель номер два перекрывался как с областью, предсказанной протоколом обнаружения энхансера, так и с экспериментально подтвержденным энхансером.

Энхансер 16 показал перекрытие как с предсказанными областями энхансера, так и с предыдущими экспериментальными данными. Enhancer Nine не перекрывался с какими-либо предсказанными энхансерами из конвейера, но показал частичное обогащение сигнала H3K4me1.