Производство и многопараметрическая флуоресцентная флуоресцентная микроскопия живых клеток (FLIM) многоклеточных сфероидов
August 9th, 2024
В данной статье мы описываем различные методы формирования многоклеточных сфероидов для проведения последующей многопараметрической микроскопии живых клеток. С помощью флуоресцентной микроскопии с визуализацией в течение жизни (FLIM), клеточной автофлуоресценции, окрашивания красителей и наночастиц продемонстрирован подход к анализу клеточного метаболизма, гипоксии и гибели клеток в живом трехмерном (3D) раке и сфероидах, полученных из стволовых клеток.
В данной работе мы представляем и сравниваем методы формирования сфероидов, которые могут быть использованы для анализа клеточного метаболизма и распределения кислорода с помощью микроскопии живых клеток. В последние годы флуоресцентная микроскопия в течение жизни широко используется для исследования метаболических биомаркеров, таких как NADPH и FAD в живых клетках, и было разработано несколько флуоресцентных наночастиц для мультиплексирования таких измерений с визуализацией оксигенации клеток и тканей. Многоклеточные сфероиды, органоиды и орган-на-чипе могут воспроизводить сложную микросреду, подобную in-vivo, сводя к минимуму потребность в исследованиях на животных.
Для производства сфероидов мы показываем различные методы формования, которые могут варьироваться от низкой до высокой производительности. Они также подчеркивают свою оптическую доступность, совместимость с флуоресцентным микроскопом для визуализации в течение всего срока службы и возможность включения компонентов внеклеточного матрикса. Таким образом, несмотря на то, что 3D-модели in vitro обеспечивают лучший контекст по сравнению с 2D-культурами, их высокая вариабельность, низкая воспроизводимость и неполная отчетность об экспериментах остаются проблемой.
Такие параметры, как размер сфероида, состав питательных веществ, внеклеточная вязкость и даже методы формирования сфероидов, могут привести к увеличению клеточной гетерогенности. С помощью этого протокола мы стремимся гармонизировать и стандартизировать методы производства сфероидов, выделяя ключевые аспекты, важные для непрерывного и многопараметрического анализа сфероидов с использованием микроскопии FLIM.
Обзор
В данной статье представлены различные методы формирования многоячеечных сфероидов для анализа метаболизма клеток и распределения кислорода с использованием микроскопии живых клеток. В исследовании подчеркивается использование микроскопии флуоресцентного времени жизни (FLIM) для исследования метаболических биомаркеров в живых клетках.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Микроскопия живых клеток
Бакграунд
- Многоячеечные сфероиды и органоиды реплицируют подобные in-vivo среды.
- Микроскопия флуоресцентного времени жизни используется для исследования метаболических биомаркеров.
- Высокая вариабельность и низкая воспроизводимость являются проблемами в 3D in vitro моделях.
- Различные методы формирования сфероидов могут применяться для различных приложений.
Цель исследования
- Сравнить методы формирования сфероидов для микроскопии живых клеток.
- Анализировать метаболизм клеток, гипоксию и клеточную смерть в 3D моделях.
- Улучшить понимание распределения кислорода в многоячеечных системах.
Использованные методы
- Микроскопия флуоресцентного времени жизни (FLIM)
- Анализ клеточной автофлуоресценции
- Использование окрашивающих красителей и флуоресцентных наночастиц
- Различные методы формирования сфероидов
Основные результаты
- Демонстрируются методы анализа метаболизма клеток в 3D сфероидах.
- Показана совместимость сфероидов с FLIM для метаболических исследований.
- Подчеркивается важность компонентов внеклеточной матрицы в формировании сфероидов.
- Рассмотрены проблемы воспроизводимости и вариабельности 3D культур.
Выводы
- Различные методы формирования сфероидов могут улучшить анализ живых клеток.
- FLIM предоставляет ценные знания о метаболических процессах в 3D моделях.
- Продолжение разработки этих методов может снизить зависимость от животных моделей.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Standardized production and multi-parameter FLIM analysis of multicellular spheroids address critical challenges in modeling tumor microenvironments for drug discovery. Harmonizing spheroid formation and live-cell imaging workflows enhances predictive confidence in metabolic and hypoxia-related readouts, supporting robust early-stage decision-making. This approach strengthens translational continuity and reduces biological risk across oncology and stem cell R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of metabolic pathways and oxygen gradients in physiologically relevant 3D models.
- Supports functional target validation by quantifying NADPH and FAD biomarkers in live spheroids.
- Facilitates biological de-risking through multiplexed metabolic and hypoxia measurements.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway modulation in complex systems.
Screening & Assay Development
- Prepares reproducible 3D spheroid models compatible with widefield, confocal, and two-photon FLIM platforms.
- Standardizes assay conditions to reduce variability and enhance quantitative output reliability.
- Enables scalable, high-throughput screening of compound effects on cell metabolism and viability.
- Supports robust evaluation of bio- and nanosensor integration for multiplexed readouts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro metabolic and hypoxia profiles with disease-relevant tumor microenvironments.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by minimizing animal model reliance.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative, multiparametric data.
- Facilitates translational biomarker development using live-cell FLIM outputs.
Pipeline & Workflow Integration
This harmonized workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation, leveraging standardized spheroid production and FLIM analytics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in 3D, in vivo-like contexts.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative metabolic and hypoxia readouts for compound triage.
- Analytics: Provides multiplexed fluorescence lifetime measurements for robust condition comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by recapitulating tumor microenvironment features.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse oncology and stem cell R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in 3D model systems.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of live-cell imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates with validated biological relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture, live-cell microscopy, and FLIM analytics.
- Demands access to widefield, confocal, or two-photon FLIM instrumentation and compatible analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of spheroid production and imaging protocols.
- May require adaptation for different cell types, extracellular matrices, or sensor integration.
- Variability in spheroid size and composition can impact reproducibility and data interpretation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:51
High‐Throughput Generation of Multicellular Spheroids from Human Cancer Cell Line for Live 3D Imaging
4:15
Assessing the Impact of Spheroid Formation Methods in 3D Cell Culture Systems Using Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)
