Производство и многопараметрическая флуоресцентная флуоресцентная микроскопия живых клеток (FLIM) многоклеточных сфероидов
9 августа 2024 г.
В данной статье мы описываем различные методы формирования многоклеточных сфероидов для проведения последующей многопараметрической микроскопии живых клеток. С помощью флуоресцентной микроскопии с визуализацией в течение жизни (FLIM), клеточной автофлуоресценции, окрашивания красителей и наночастиц продемонстрирован подход к анализу клеточного метаболизма, гипоксии и гибели клеток в живом трехмерном (3D) раке и сфероидах, полученных из стволовых клеток.
В данной работе мы представляем и сравниваем методы формирования сфероидов, которые могут быть использованы для анализа клеточного метаболизма и распределения кислорода с помощью микроскопии живых клеток. В последние годы флуоресцентная микроскопия в течение жизни широко используется для исследования метаболических биомаркеров, таких как NADPH и FAD в живых клетках, и было разработано несколько флуоресцентных наночастиц для мультиплексирования таких измерений с визуализацией оксигенации клеток и тканей. Многоклеточные сфероиды, органоиды и орган-на-чипе могут воспроизводить сложную микросреду, подобную in-vivo, сводя к минимуму потребность в исследованиях на животных.
Для производства сфероидов мы показываем различные методы формования, которые могут варьироваться от низкой до высокой производительности. Они также подчеркивают свою оптическую доступность, совместимость с флуоресцентным микроскопом для визуализации в течение всего срока службы и возможность включения компонентов внеклеточного матрикса. Таким образом, несмотря на то, что 3D-модели in vitro обеспечивают лучший контекст по сравнению с 2D-культурами, их высокая вариабельность, низкая воспроизводимость и неполная отчетность об экспериментах остаются проблемой.
Такие параметры, как размер сфероида, состав питательных веществ, внеклеточная вязкость и даже методы формирования сфероидов, могут привести к увеличению клеточной гетерогенности. С помощью этого протокола мы стремимся гармонизировать и стандартизировать методы производства сфероидов, выделяя ключевые аспекты, важные для непрерывного и многопараметрического анализа сфероидов с использованием микроскопии FLIM.
Обзор
В данной статье представлены различные методы формирования многоклеточных сфероидов для анализа клеточного метаболизма и распределения кислорода с помощью микроскопии живых клеток. В исследовании освещается использование микроскопии с визуализацией времени жизни флуоресценции (FLIM) для изучения метаболических биомаркеров в живых клетках.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Визуализация живых клеток
Теоретические основы
- Многоклеточные сфероиды и органоиды воспроизводят микроокружение, подобное условиям in vivo.
- Микроскопия с визуализацией времени жизни флуоресценции используется для изучения метаболических биомаркеров.
- Высокая вариабельность и низкая воспроизводимость являются основными проблемами 3D-моделей in vitro.
- Для различных целей могут применяться разные методы формирования сфероидов.
Цель исследования
- Сравнить методы формирования сфероидов для микроскопии живых клеток.
- Проанализировать метаболизм клеток, гипоксию и гибель клеток в 3D-моделях.
- Углубить понимание распределения кислорода в многоклеточных системах.
Используемые методы
- Микроскопия с визуализацией времени жизни флуоресценции (FLIM)
- Анализ клеточной автофлуоресценции
- Использование красителей и флуоресцентных наночастиц
- Различные методы формирования сфероидов
Основные результаты
- Продемонстрированы методы анализа клеточного метаболизма в 3D-сфероидах.
- Показана совместимость сфероидов с методом FLIM для метаболических исследований.
- Подчеркнута важность компонентов внеклеточного матрикса при формировании сфероидов.
- Рассмотрены проблемы воспроизводимости и вариабельности 3D-культур.
Выводы
- Различные методы формирования сфероидов позволяют улучшить анализ живых клеток.
- Метод FLIM предоставляет ценные сведения о метаболических процессах в 3D-моделях.
- Дальнейшее развитие этих методов может снизить зависимость от использования животных моделей.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Стандартизированное производство и многопараметрический анализ FLIM многоклеточных сфероидов позволяют решить критические проблемы моделирования микроокружения опухоли для поиска новых лекарственных средств. Гармонизация процессов формирования сфероидов и визуализации живых клеток повышает достоверность прогнозов показателей метаболизма и гипоксии, что способствует принятию обоснованных решений на ранних этапах разработки. Данный подход укрепляет трансляционную преемственность и снижает биологические риски в портфелях исследований и разработок в области онкологии и стволовых клеток.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать метаболические пути и градиенты кислорода в физиологически релевантных 3D-моделях.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем количественного определения биомаркеров NADPH и FAD в живых сфероидах.
- Способствует биологическому снижению рисков за счет мультиплексного измерения метаболизма и гипоксии.
- Повышает прогностическую достоверность взаимодействия с мишенью и модуляции путей в сложных системах.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет создавать воспроизводимые 3D-модели сфероидов, совместимые с платформами широкопольной, конфокальной и двухфотонной FLIM-микроскопии.
- Стандартизирует условия анализа для снижения вариабельности и повышения надежности количественных результатов.
- Обеспечивает масштабируемый высокопроизводительный скрининг влияния соединений на метаболизм и жизнеспособность клеток.
- Поддерживает надежную оценку интеграции био- и наносенсоров для мультиплексного считывания данных.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит профили метаболизма и гипоксии in vitro в соответствие с микроокружением опухоли, характерным для заболевания.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации за счет минимизации зависимости от животных моделей.
- Позволяет принимать обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем продвижении на основе количественных многопараметрических данных.
- Способствует разработке трансляционных биомаркеров с использованием результатов FLIM живых клеток.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Этот гармонизированный рабочий процесс объединяет этапы от раннего поиска до идентификации соединений-лидеров и доклинической валидации, используя стандартизированное производство сфероидов и FLIM-аналитику.
- Поиск новых биологических механизмов: обеспечивает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей в условиях 3D-моделей, приближенных к условиям in vivo.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые количественные показатели метаболизма и гипоксии для отбора перспективных соединений.
- Аналитика: обеспечивает мультиплексные измерения времени жизни флуоресценции для надежного сравнения условий.
- Трансляционные исследования: связывает результаты in vitro с доклиническими моделями путем воспроизведения характеристик микроокружения опухоли.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу для различных программ НИОКР в области онкологии и стволовых клеток.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность в системах 3D-моделирования.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость рабочих процессов визуализации живых клеток.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и повышает эффективность использования капитала за счет предоставления надежных количественных данных.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритезацию с учетом рисков и продвигать кандидатов с подтвержденной биологической релевантностью.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с трехмерным (3D) культивированием клеток, микроскопией живых клеток и анализом FLIM.
- Необходим доступ к оборудованию для широкопольной, конфокальной или двухфотонной FLIM-микроскопии и совместимому программному обеспечению для анализа.
- Необходима межгрупповая стандартизация протоколов получения сфероидов и проведения визуализации.
- Может потребоваться адаптация метода для различных типов клеток, внеклеточных матриксов или интеграции сенсоров.
- Вариативность размера и состава сфероидов может повлиять на воспроизводимость и интерпретацию данных.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:51
High‐Throughput Generation of Multicellular Spheroids from Human Cancer Cell Line for Live 3D Imaging
4:15
Assessing the Impact of Spheroid Formation Methods in 3D Cell Culture Systems Using Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)
