Расширенная экстракция низкомолекулярной ДНК из сточных вод для комплексной оценки устойчивости к противомикробным препаратам
19 июля 2024 г.
В этой статье мы представляем простой метод оценки устойчивости к противомикробным препаратам (УПП) окружающей среды путем увеличения доли внеклеточной ДНК с низкой молекулярной массой. Предварительная обработка 20%-30% ПЭГ и 1,2 М NaCl позволяет обнаруживать как геномные, так и горизонтально перенесенные гены AMR. Протокол позволяет использовать процесс без наборов с дополнительной оптимизацией.
Нас интересуют эволюция, передача и молекулярные механизмы, лежащие в основе устойчивости к антибиотикам. В частности, работа, которая легла в основу этой статьи, проистекает из нашего интереса к устойчивости к окружающей среде. В настоящее время мы пытаемся создать локальную базу данных для отслеживания пространственных временных изменений устойчивости к противомикробным препаратам, используя данные за один год.
Комбинация методов, основанных на культурах, и геномики используется для выявления и мониторинга устойчивости к противомикробным препаратам. ДНК из образцов подвергается ПЦР или секвенированию из дробовика для профилирования микробного разнообразия и выявления генов устойчивости. Кроме того, метабаркодирование и панели AMR на основе генов используются для расширенного обнаружения AMR.
Известно, что фрагментированная низкомолекулярная ДНК является резервуаром генов AMR, но мало внимания уделялось разработке методов, специфичных для высокопродуктивной экстракции линейной и низкомолекулярной ДНК. Наша работа направлена на устранение этого пробела. Наш протокол включает в себя простой этап предварительной обработки для обогащения доли низкомолекулярной ДНК, извлеченной из сточных вод.
В результате, это полностью захватывает УПП окружающей среды, не исключая свободные фракции ДНК. Этот протокол может быть преобразован в метод, не требующий набора, если приложит немного больше усилий. В свою очередь, это открывает путь к разработке экономически эффективных методов улавливания УПП в окружающей среде.
Мы хотим выйти за рамки мутационной резистентности и изучить вклад негенетических механизмов в устойчивость к антибиотикам. В частности, нас интересует сравнение относительного вклада горизонтального переноса генов и геномных мутаций в адаптацию к антибиотикам в различных условиях.
Обзор
В данном исследовании разработан новый метод оценки антимикробной резистентности (АМР) в окружающей среде путем обогащения низкомолекулярной внеклеточной ДНК из проб сточных вод. Протокол позволяет обнаруживать геномные и горизонтально перенесенные гены АМР, предлагая экономически эффективный метод мониторинга АМР в окружающей среде без использования специализированных наборов.
Основные компоненты исследования
Область исследований
- Антимикробная резистентность (АМР)
- Экологическая микробиология
- Молекулярная генетика
Теоретические сведения
- Эволюция и передача антибиотикорезистентности в условиях окружающей среды
- Современные недостатки методов высокоэффективной экстракции низкомолекулярной ДНК
- Важность мониторинга антибиотикорезистентности для общественного здравоохранения
Используемые методы
- ПЦР и дробовое секвенирование для профилирования микробного разнообразия
- Использование полиэтиленгликоля и хлорида натрия для экстракции ДНК
- Усовершенствованное обнаружение AMR с помощью метабаркодинга и генных панелей
Основные результаты
- Улучшенное извлечение линейной и низкомолекулярной ДНК
- Успешный захват как геномных, так и свободных фракций ДНК, связанных с AMR
- Базовая работа для будущих разработок в методах обнаружения AMR в окружающей среде
Выводы
- В исследовании представлен эффективный метод оценки антибиотикорезистентности (AMR) в окружающей среде
- Способствует дальнейшему изучению как генетических, так и негенетических факторов, способствующих развитию устойчивости к антибиотикам
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Комплексное обнаружение антимикробной резистентности (АМР) в пробах окружающей среды имеет решающее значение для ранней оценки рисков и эпидемиологического надзора в сфере общественного здравоохранения. Улучшенная экстракция низкомолекулярной ДНК из сточных вод позволяет более полно профилировать резервуары генов АМР, включая те, что распространяются посредством горизонтального переноса генов. Эта возможность повышает достоверность прогнозов при мониторинге АМР в окружающей среде и служит основой для принятия решений по выбору стратегий надзора и смягчения последствий.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать резервуары генов AMR в окружающей среде за пределами внутриклеточной ДНК.
- Обеспечивает функциональную проверку мобильности генов AMR и путей их передачи.
- Повышает достоверность прогнозов в моделях экологических рисков возникновения AMR.
Скрининг и разработка методов анализа
- Облегчает подготовку образцов ДНК, подходящих для метагеномных панелей и панелей ПЦР для анализа AMR.
- Повышает воспроизводимость анализа за счет стандартизации экстракции фрагментированной и внеклеточной ДНК.
- Обеспечивает надежное обнаружение низкокопийных фрагментов генов AMR для последующего анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит экологический мониторинг AMR в соответствие с поиском трансляционных биомаркеров для нужд общественного здравоохранения.
- Обеспечивает непрерывность процесса от обнаружения в окружающей среде до доклинической оценки риска распространения AMR.
- Позволяет снизить риски за счет понимания механизмов, выявляя как генетические, так и горизонтально переносимые элементы резистентности.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод экстракции интегрирован в систему экологического мониторинга, охватывающую все этапы: от сбора образцов до метагеномного анализа и профилирования генов AMR.
- Открывающая биология: позволяет проверять гипотезы о распространенности и мобильности генов AMR в сточных водах.
- Скрининг: стандартизирует экстракцию ДНК для воспроизводимого количественного обнаружения генов AMR.
- Аналитика: обеспечивает получение высоковыходной низкомолекулярной ДНК для надежного сравнительного анализа различных образцов и временных точек.
- Трансляционные исследования: связывает обнаружение AMR в окружающей среде со стратегиями поиска биомаркеров в общественном здравоохранении.
- Корпоративное повторное использование: предлагает масштабируемый протокол, не зависящий от конкретных наборов, который может быть адаптирован к различным матрицам окружающей среды.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозирования при эпидемиологическом надзоре за AMR за счет выделения фрагментированной и внеклеточной ДНК.
- Практическая ценность: предоставляет стандартизированный протокол экстракции с высоким выходом, подходящий для рутинного мониторинга.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать обоснованные решения о целесообразности инвестиций в меры по смягчению последствий AMR и системы надзора.
- Влияние на портфель проектов: способствует приоритизации программ экологического мониторинга AMR с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуются навыки экстракции экологической ДНК и последующего молекулярного анализа.
- Необходим доступ к центрифугированию, спектрофотометрии и стандартной инфраструктуре для молекулярно-биологических исследований.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости обработки образцов и сопоставимости данных.
- Метод может быть адаптирован к различным типам сточных вод и проб окружающей среды путем оптимизации протокола.
- Ограничивающим фактором является необходимость осторожного обращения с фрагментированной ДНК во избежание ее потерь в процессе обработки.
