ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Мы хотели бы поблагодарить доктора Цзюэ Лю за его любезную помощь. Данное исследование было поддержано грантами Национальной программы ключевых исследований и разработок Китая (No 2022YFD1800300), Национального фонда естественных наук Китая (No 32130105) и Целевого фонда современной системы исследований в области агропромышленных технологий (No 2022YFD1800300), Национального фонда естественных наук Китая (No ) и Целевого фонда современной системы исследований в области агропромышленных технологий (No 2022YFD1800300). CARS-40), Китай.

Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованном в исследовании, приведена в Таблице материалов.
1. Подготовка образцов ячеек
<ol><li>Культивирование клеток DF-1 (бессмертных фибробластов куриного эмбриона) в шестилуночных планшетах (5 x 105 клеток на лунку) с модифицированной средой Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 при 38 °C.</li>
	<li>Когда клетки достигнут 80% конфлюенции, выбросьте содержащую сыворотку среду для клеточных культур, трижды промойте клетки фосфатно-солевым буфером (PBS), а затем добавьте по 2 мл бессывороточной среды для клеточных культур в каждую лунку.</li>
	<li>Добавьте в каждую лунку вирусный раствор IBDV (содержащий рассчитанный MOI) и настройте фиктивный инфекционный контроль, добавив объем DMEM, равный объему вирусного раствора.</li>
	<li>После 1 ч адсорбции вируса выбросьте питательную среду, трижды промойте клетки PBS, добавьте в каждую лунку по 2 мл DMEM с добавлением 2% FBS и продолжайте культивирование клеток в течение 24 ч.</li>
	<li>Через 24 ч после инфекции ВЗК провести лечение трипсином (500 мкл на лунку) в течение 1 мин и затем нейтрализовать ДМЭМ с добавлением 10% FBS (2 мл на лунку). После этого клетки должны быть собраны для приготовления суспензий одиночных клеток для проточной цитометрии.</li>
	<li>Центрифугируйте ячейки при 400 x g в течение 5 мин при 2-8 °C. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.</li>
	<li>Повторно суспендируйте клеточную гранулу в PBS и аккуратно закрутите трубки в течение 3 с.</li>
	<li>Центрифугируйте ячейки, как описано на шаге 1.6 (400 x g в течение 5 мин при 2-8 °C).</li>
	<li>Повторите промывку ячеек, как описано в шаге 1.7 и шаге 1.8.</li>
	<li>Проведите подсчет клеток с помощью гемоцитометра под микроскопом. Затем ресуспендируйте клетки в соответствующем объеме буфера для окрашивания проточной цитометрией (так, чтобы конечная концентрация клеток составляла 1 x 107 клеток/мл). Аккуратно закрутите суспензии.</li>
</ol>2. Окрашивание клеток для проточной цитометрии
<ol><li>Добавьте 100 мкл одноклеточных суспензий из стадии 1,10 в 5 мл полистирольных пробирок с круглым дном (12 мм × 75 мм). Подготовьте фиктивные клетки и клетки, инфицированные IBDV, для окрашивания антителами к chGSDME-NT/CT и используйте нормальный мышиный IgG в качестве контроля изотипа. Тем временем подготовьте холостые контрольные и одиночные окрашенные пробирки с клетками, инфицированными IBDV.</li>
	<li>Добавьте 1 г либо меченного Alexa Fluor 647 анти-chGSDME-NT MCAB, либо анти-chGSDME-CT McAb или нормального мышиного IgG (в качестве изотипа контроля) в пробирки, инфицированные IBDV, и фиктивные контрольные пробирки соответственно. Впоследствии аккуратно проведите по трубкам вихрь в течение 3 с.</li>
	<li>Окрашенные клетки инкубировать при температуре 2-8 °C или на льду в течение 30 минут в темноте. Осторожно перекручивайте трубки каждые 10 минут.</li>
	<li>Промойте клетки 1 мл буфера для окрашивания проточной цитометрией центрифугированием при 400 x g в течение 5 мин при 2-8 °C. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.</li>
	<li>Повторите промывку ячеек, как описано в шаге 2.4.</li>
	<li>Ресуспендируйте гранулу в 100 мкл буфера для окрашивания проточной цитометрией.</li>
	<li>Окрашивают клетки группы, инфицированной IBDV, и псевдоинфицированной группы, а также PI-одинарно окрашенных пробирок 10 мкг/мл PI в течение 10 мин при комнатной температуре с последующим добавлением 400 мкл буфера для окрашивания проточной цитометрией для анализа проточной цитометрии.</li>
</ol>3. Проведение анализа проточной цитометрии
<ol><li>Включите проточный цитометр для инициализации прибора и запустите программное обеспечение.</li>
	<li>Начните с запуска пустой контрольной трубки, за которой последуют одиночные окрашенные трубки для регулировки напряжения и компенсационных параметров проточного цитометра. Используйте флуоресцентные каналы FL3 и FL4, которые излучают на длине волны 635 нм, для обнаружения флуорофоров PI и Alexa Fluor 647 соответственно.</li>
	<li>После настройки всех параметров последовательно запустите все сэмплы.</li>
</ol>4. Анализ данных проточной цитометрии
<ol><li>Проанализируйте окрашивание Alexa Fluor 647 каждого образца на гистограмме канала FL4.</li>
	<li>Чтобы оценить долю двойных положительных клеток в каждом образце, используйте четырехквадрантную точечную диаграмму FL3/FL4.</li>
	<li>Установите положительные пороговые значения на основе образцов с двойным окрашиванием IgG/PI с контролем изотипа, гарантируя, что доля двойных положительных клеток остается ниже 1%. Такой подход позволяет измерить долю двойных положительных клеток во всех образцах.</li>
</ol>

Количественная оценка пироптоза в клетках DF-1, инфицированных вирусом бурсальной инфекции

<ol><li>He, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gasdermin+D+is+an+executor+of+pyroptosis+and+is+required+for+interleukin-1%CE%B2+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Gasdermin D is an executor of pyroptosis and is required for interleukin-1β secretion.</a> Cell Res. 25 (12), 1285-1298 (2015).</li>
<li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-11+cleaves+Gasdermin+D+for+non-canonical+inflammasome+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Caspase-11 cleaves Gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling.</a> Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+GSDMD+by+inflammatory+caspases+determines+pyroptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death.</a> Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).</li>
<li>Angosto-Bazarra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+analyses+of+the+Dasdermin+family+suggest+conserved+roles+in+infection+response+despite+loss+of+pore-forming+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary analyses of the Dasdermin family suggest conserved roles in infection response despite loss of pore-forming functionality.</a> BMC Biol. 20 (1), 9(2022).</li>
<li>De Schutter, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Punching+holes+in+cellular+membranes%3A+Biology+and+evolution+of+gasdermins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Punching holes in cellular membranes: Biology and evolution of gasdermins.</a> Trends Cell Biol. 31 (6), 500-513 (2021).</li>
<li>Kovacs, S. B., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gasdermins%3A+Effectors+of+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Gasdermins: Effectors of pyroptosis.</a> Trends Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).</li>
<li>Jiang, S., Gu, H., Zhao, Y., Sun, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teleost+gasdermin+E+is+cleaved+by+caspase+1%2C+3%2C+and+7+and+induces+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Teleost gasdermin E is cleaved by caspase 1, 3, and 7 and induces pyroptosis.</a> J Immunol. 203 (5), 1369-1382 (2019).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duck+gasdermin+E+is+a+substrate+of+caspase-3%2F-7+and+an+executioner+of+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Duck gasdermin E is a substrate of caspase-3/-7 and an executioner of pyroptosis.</a> Front Immunol. 13, 1078526(2022).</li>
<li>Müller, H., Islam, M. R., Raue, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+on+infectious+bursal+disease-the+past%2C+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Research on infectious bursal disease-the past, the present and the future.</a> Vet Microbiol. 97 (1), 153-165 (2003).</li>
<li>Müller, H., Scholtissek, C., Becht, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+infectious+bursal+disease+virus+consists+of+two+segments+of+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The genome of infectious bursal disease virus consists of two segments of double-stranded RNA.</a> J Virol. 31 (3), 584-589 (1979).</li>
<li>Cubas-Gaona, L. L., Diaz-Beneitez, E., Ciscar, M., Rodríguez, J. F., Rodríguez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exacerbated+apoptosis+of+cells+infected+with+infectious+bursal+disease+virus+upon+exposure+to+interferon+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Exacerbated apoptosis of cells infected with infectious bursal disease virus upon exposure to interferon alpha.</a> J Virol. 92 (11), (2018).</li>
<li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+upregulation+of+chicken+microRNA-16-5p+expression+in+DF-1+cells+following+infection+with+infectious+bursal+disease+virus+%28IBDV%29+enhances+IBDV-induced+apoptosis+and+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Epigenetic upregulation of chicken microRNA-16-5p expression in DF-1 cells following infection with infectious bursal disease virus (IBDV) enhances IBDV-induced apoptosis and viral replication.</a> J Virol. 94 (2), e01724(2020).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+voltage-dependent+anion+channel+2+in+infectious+bursal+disease+virus-induced+apoptosis+in+host+cells+via+interaction+with+VP5%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Critical role for voltage-dependent anion channel 2 in infectious bursal disease virus-induced apoptosis in host cells via interaction with VP5.</a> J Virol. 86 (3), 1328-1338 (2012).</li>
<li>Rodríguez-Lecompte, J. C., Niño-Fong, R., Lopez, A., Frederick Markham, R. J., Kibenge, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+bursal+disease+virus+%28IBDV%29+induces+apoptosis+in+chicken+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Immunol+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Infectious bursal disease virus (IBDV) induces apoptosis in chicken B cells.</a> Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 28 (4), 321-337 (2005).</li>
<li>Wang, S., Liu, Y., Zhang, L., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+monitoring+cancer+cell+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Methods for monitoring cancer cell pyroptosis.</a> Cancer Biol Med. 19 (4), 398-414 (2021).</li>
<li>Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+changes+during+programmed+cell+deaths%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane changes during programmed cell deaths.</a> Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyroptosis+is+driven+by+non-selective+gasdermin-d+pore+and+its+morphology+is+different+from+mlkl+channel-mediated+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-d pore and its morphology is different from mlkl channel-mediated necroptosis.</a> Cell Research. 26 (9), 1007-1020 (2016).</li>
</ol>

Авторам нечего раскрывать.

В данной статье описан эффективный метод исследования пироптоза с помощью проточной цитометрии, полученный путем двойного окрашивания инфицированных клеток мечеными Alexa Fluor 647 анти-chGSDME-NT McAb и PI. Этот подход также может быть применен к различным типам клеток для дифференциации пироптоза от других типов клеточной гибели, таких как апоптоз и некроз.
Пироптоз, воспалительный тип запрограммированной гибели клеток, в первую очередь зависящий от образования D-индуцированных Gasdermin (GSDM) пор плазматической мембраны у млекопитающих 1,2,3, традиционно оценивался с помощью таких методов, как высвобождение LDH 6,15, морфологические особенности16 и обнаружение фрагментов GSDM-NT/GSDM-CT с помощью вестерн-блоттинга или анализов IFA17. Однако ни один из этих методов не позволяет точно количественно определить процент пироптотических клеток. В этом исследовании используются характерные поры плазматической мембраны в пироптотических клетках, образованные фрагментами GSDM-NT, для разработки стратегии их определения, основанной на проточной цитометрии.
Когда клетки подвергали двойному окрашиванию с помощью chGSDME-NT-Alexa Fluor 647 и PI и последующему анализу с помощью проточной цитометрии в флуоресцентных каналах FL3 и FL4, пироптоз можно было различить по двум параметрам одновременно: окрашивание chGSDME-NT-Alexa Fluor 647, указывающее на образование пор плазматической мембраны N-концевым фрагментом расщепленного chGSDME, и окрашивание PI, указывающее на разрыв плазматической мембраны. Данные показывают, что доля двойных положительных клеток chGSDME-NT/PI в клетках, инфицированных IBDV (примерно 33%), была значительно выше, чем в контрольной группе с фиктивным инфицированием (P < 0,001).
Экспериментальный метод требует нескольких соображений для обеспечения точности и надежности. Во-первых, каждая пробирка для образца, используемая для анализа потока, должна содержать не менее 1 x 106 ячеек для поддержания точности анализа потока. Учитывая многократность этапов промывки в протоколе, целесообразно увеличить начальное количество клеток в каждой пробирке на шаге 2.1 соответственно, например, до 2 х 106 ячеек. Очень важно обращаться с промывкой и переносом клеток с особой осторожностью, чтобы избежать непреднамеренного нарушения целостности клеток. Кроме того, имейте в виду, что плотность клеток, концентрация антител и продолжительность операции могут влиять на оптимальные настройки параметров. Поэтому необходимо корректировать параметры и настройки проточного цитометра исходя из конкретных условий эксперимента. В данном исследовании использовались следующие параметры: FSC AmpGain был установлен на 1,40, а напряжение SSC — на 490 В. Вентиль на графике FSC/SSC был настроен на покрытие всех популяций клеток для последующего анализа FL3/4-каналов. Напряжение флуоресценции было установлено на 600 В для канала FL3 (PI) и 600 В для канала FL4 (Alexa Fluor 647). Компенсация была установлена на уровне 38,0% между каналами FL4 и FL3. Скорость потока была установлена на уровне 200 событий/с, а пороговое значение событий было установлено на уровне 10 000.
Благодаря новому подходу понимание роли GSDME-опосредованного пироптоза в ответе хозяина на патогенные инфекции у цыплят и лежащих в его основе механизмов значительно продвинулось вперед. Благодаря использованию специфических антител мы смогли исследовать порообразующий chGSDME-NT с помощью проточной цитометрии, отличая пироптотические клетки от других и облегчая определение доли клеток, подвергающихся пироптозу. В результате, этот метод имеет явное преимущество перед вестерн-блоттингом или анализом IFA в обнаружении пироптотических клеток.
Однако ограничение этого протокола заключается в использовании N-концевого фрагмента куриного GSDME в клетках, инфицированных IBDV, в качестве экспериментальной модели для изучения пироптоза. Тем не менее, это исследование знаменует собой первое успешное использование проточной цитометрии для определения пироптоза.
Таким образом, описанный здесь метод проточной цитометрии для изучения пироптоза обладает большим потенциалом для углубления нашего понимания механизмов пироптоза как у млекопитающих, так и у птиц. Этот метод является эффективным инструментом, способствующим исследованиям клеточной смерти в науках о жизни.

Пироптоз является воспалительным типом запрограммированной гибели клеток, который в основном зависит от образования пор плазматической мембраны газдермином (GSDM) D у млекопитающих 1,2,3. Из-за генетической недостаточности GSDMD у цыплят 4,5 механизм пироптоза у цыплят остается неуловимым. Семейство Gasdermin включает консервативные белки, включая GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME и DFNB59 3,6. Исследования показали, что GSDME из костистых рыб и уток расщепляется каспазой-1/3/7 или каспазой-3/7, вызывая гибель пироптотических клеток 7,8. Тем не менее, роль GSDME-опосредованного пироптоза в ответе хозяина на патогенные инфекции у цыплят еще предстоит выяснить.
Инфекционная бурсальная болезнь (ВЗК) — это острое, высококонтагиозное и иммуносупрессивное заболевание домашней птицы, вызываемое ВЗК9. IBDV, безоболочечный двухцепочечный РНК-вирус, принадлежит к роду Avibirnavirus семейства Birnaviridae10. Предыдущие исследования, проведенные другими организациями и нашей лабораторией, показали, что инфекция ВЗК вызывает гибель клеток хозяина различными путями 11,12,13,14. Предыдущие результаты показали, что инфекция IBDV вызывает высвобождение лактатдегидрогеназы (LDH), показателя гибели литических клеток 6,15, что позволяет предположить, что инфекция IBDV вызывает гибель литических клеток в клетках-хозяевах. Кроме того, данные показывают, что клетки, инфицированные IBDV, демонстрируют морфологические особенности пироптотической гибели клеток, включая набухание клеток с крупными пузырьками, выдувающимися из плазматической мембраны, и положительное окрашивание пропидида йодидом (PI), что позволяет предположить, что инфекция IBDV вызывает пироптоз в клетках.
Учитывая, что образование мембранных пор в пироптотических клетках N-концевым фрагментом расщепленного GSDM (GSDM-NT) является отличительной чертой пироптоза, теоретически пироптотические клетки могут быть обнаружены методом проточной цитометрии путем исследования GSDM-NT на клеточной мембране с использованием специфических антител. В пироптотических клетках птиц N-концевой фрагмент куриного гасдермина Е (chGSDME-NT) образует мембранные поры, позволяя йодиду пропидия (PI) проходить через ДНК и связываться с ней. Таким образом, долю пироптотических клеток можно определить с помощью проточной цитометрии, тем самым отличая пироптоз от других форм гибели клеток, таких как апоптоз и некроз. Однако о методе исследования пироптотических клеток методом проточной цитометрии не сообщалось. В этом исследовании клетки DF-1 были инфицированы IBDV, и была проведена проточная цитометрия для изучения пироптотических клеток с использованием моноклональных антител (MCAB) против фрагмента chGSDME-NT (мембранно-связанного) и окрашивания PI. Удивительно, но пироптотические клетки были эффективно обнаружены с помощью проточной цитометрии. Кроме того, можно количественно определить долю пироптотических клеток. Эти результаты являются мощным и эффективным средством для определения пироптоза.
В данной статье описан метод исследования пироптоза в клетках, инфицированных IBDV, методом проточной цитометрии с использованием окрашивания анти-chGSDME-NT McAb и PI. Этот метод также может быть распространен на другие клетки, инфицированные патогенами, и применен для исследования различных типов клеток с пироптозом, отличая их от других форм клеточной смерти.

<table><tbody><tr><td>Полистирольная трубка с круглым дном объемом 5 мл (12 & 75 мм)</td><td>Corning Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>6 лунок Cell Culture Plate</td><td></td><td>Corning 3516</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 наборы для мечения антител</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A20186</td><td></td></tr><tr><td>Anti-chGSDME-CT McAb</td><td>SAE Biomedical Tech Company (Чжуншань, Китай)</td><td>EU0228</td><td></td></tr><tr><td>Anti-chGSDME-NT McAb</td><td>SAE Biomedical Tech Company (Чжуншань, Китай)</td><td>EU0227</td><td></td></tr><tr><td>Программное обеспечение CellQuest</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>инкубатор Thermo Fisher Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>Криогенная замораживающая центрифуга</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Модифицированная орлиная среда Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)&nbsp;</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0193-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Проточный цитометр</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSКалибур</td><td></td></tr><tr><td>Проточная цитометрия Окрашивающий буфер</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>Гемоцитометр</td><td>Цю-цзин Биохимический реактив и Instrument Company (Шанхай, Китай)</td><td>YX-JSB52</td><td></td></tr><tr><td>штамм IBDV Lx штамм</td><td></td><td></td><td>IBDV Lx был любезно предоставлен доктором Цзюэ Лю, Пекинская академия сельского и лесного хозяйства, Пекин, Китай</td></tr><tr><td>Инвертированный микроскоп</td><td>Chongqing Photoelectric Instrument Company</td><td>XDS-1B</td><td></td></tr><tr><td>Нормальная мышь IgG</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2025</td><td></td></tr><tr><td>Фосфатный буферный раствор (PBS)</td><td>Слияния и поглощения С&nbsp; Генная технология</td><td>CC017</td><td></td></tr><tr><td>Пропидид йодид(ПИ)</td><td>Сигма-Олдрич</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Трипсин-ЭДТА, 0,25%</td><td>M& С&nbsp; Генотехника</td><td>CC008</td><td></td></tr><tr><td>Вихревой генератор</td><td>MIULAB</td><td>MIX-28+</td><td></td></tr></tbody></table>

Исследование пироптоза методом проточной цитометрии

Examination of Pyroptosis by Flow Cytometry

Пироптоз — это воспалительный тип запрограммированной гибели клеток, вызванный преимущественно образованием пор плазматической мембраны N-концом, образованным из расщепленных белков семейства Gasdermin (GSDM). Исследование прикрепленного к мембране GSDM-NT методом вестерн-блоттинга является наиболее часто используемым методом оценки пироптоза. Однако дифференцировать клетки с пироптозом от других форм клеточной гибели с помощью этого метода сложно. В этом исследовании клетки DF-1, инфицированные вирусом инфекционной бурсальной болезни (IBDV), были использованы в качестве модели для количественной оценки доли клеток, подвергающихся пироптозу, с помощью проточной цитометрии с использованием специфических антител против N-концевого фрагмента куриного GSDME (chGSDME-NT) и окрашивания йодидом пропидия (PI). ChGSDME-NT-положительные клетки были легко обнаруживаемы с помощью проточной цитометрии с использованием меченых Alexa Fluor 647 антител против chGSDME-NT. Более того, доля двойных положительных клеток chGSDME-NT/PI в клетках, инфицированных IBDV (около 33%), была значительно выше, чем в контрольной группе с фиктивным инфицированием (P < 0,001). Эти результаты указывают на то, что исследование мембраносвязанного chGSDME-NT с помощью проточной цитометрии является эффективным подходом для определения пироптотических клеток среди клеток, подвергающихся клеточной гибели.

chGSDME-NT на мембране клеток DF-1 с инфекцией IBDV может быть легко обнаружен с помощью проточной цитометрии Одной из наиболее важных особенностей пироптотических клеток является образование мембранных пор фрагментами GSDM-NT, образующимися в результате расщепления Gasdermin. Таким образом, пироптотические клетки теоретически могут быть обнаружены с помощью проточной цитометрии путем исследования GSDM-NT на клеточных мембранах с использованием специфических антител. Таким образом, клетки DF-1 были инфицированы IBDV, а пироптотические клетки были исследованы с помощью проточной цитометрии с использованием меченого Alexa Fluor 647 анти-chGSDME-NT McAb и окрашивания PI. Значительное количество chGSDME-NT-положительных клеток было обнаружено с помощью проточной цитометрии после инфекции IBDV (Рисунок 1). Напротив, фиктивно инфицированные контрольные клетки или клетки, окрашенные контролем изотипа IgG, показали минимальное количество Alexa Fluor-647-положительных клеток. Эти результаты демонстрируют эффективное и специфичное обнаружение мембраносвязанного chGSDME-NT с помощью проточной цитометрии. Следует отметить, что, поскольку С-концевые фрагменты расщепленного chGSDME (chGSDME-CT) оставались внутри цитоплазмы, а не перемещались на плазматическую мембрану, как chGSDME-NT, фрагменты chGSDME-CT были едва обнаруживаемы с помощью проточной цитометрии с использованием окрашивания поверхности мембраны антигеном, что согласуется с тем фактом, что пироптоз был связан с мембранно-связанными фрагментами chGSDME-NT.
Пироптоз в клетках DF-1 может быть определен с помощью проточной цитометрии с использованием двойного окрашивания клеток мечеными флуоресцеином анти-chGSDME-NT MCAB и PI Когда клетки подвергали двойному окрашиванию мечеными Alexa Fluor 647 анти-chGSDME-NT McAb и PI, с последующим анализом проточной цитометрии в флуоресцентных каналах FL3 и FL4, пироптотические клетки можно было определить по положительному окрашиванию chGSDME-NT и PI. Как показано на рисунках 2A, B, значительное количество cGSDME-NT-положительных клеток с инфекцией IBDV было обнаружено с помощью анализов проточной цитометрии, и доля двойных положительных клеток chGSDME-NT/PI в клетках, инфицированных IBDV (около 33%), была значительно выше, чем у фиктивно-инфицированных контрольных групп (P &lt; 0,001), что позволяет предположить, что образование мембранных пор chGSDME-NT был синхронен с разрушением клеточных мембран, тем самым вызывая пироптотическую гибель этих инфицированных IBDV клеток. Эти данные ясно показывают, что инфекция IBDV индуцирует chGSDME-опосредованный пироптоз в клетках хозяина. В то время как одиночные положительные клетки PI могут представлять другие формы клеточной гибели, вызванные инфекцией IBDV. Таким образом, исследование порообразующего chGSDME-NT с помощью проточной цитометрии является ценным методом дифференциации пироптотических клеток от тех, которые подвергаются другим формам клеточной гибели.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66912/66912fig01.jpg"> Рисунок 1: Исследование связанных с chGSDME-NT клеток методом проточной цитометрии. Клетки DF-1 были фиктивно инфицированы или инфицированы IBDV при MOI 1. Через 24 ч после заражения клетки собирали и окрашивали меченным Alexa Fluor 647 анти-chGSDME-NT / анти-chGSDME-CT McAb или контротипом изотипа IgG, а также анализировали с помощью проточной цитометрии. Положительное окрашивание chGSDME-NT в анализе проточной цитометрии показало мембраносвязанные клетки chGSDME-NT с пироптозом, индуцированным IBDV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66912/66912fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66912/66912fig02.jpg"> Рисунок 2: Исследование пироптоза методом проточной цитометрии с использованием двойного окрашивания с помощью chGSDME-NT и PI. (A) Точечный анализ пироптотических клеток с помощью проточной цитометрии. Клетки DF-1 были инфицированы ВЗК при MOI 1. Через 24 ч после заражения клетки собирали, окрашивали меченными Alexa Fluor 647 анти-chGSDME-NT / анти-chGSDME-CT McAb и PI, а также анализировали с помощью проточной цитометрии. (В) Процентное соотношение пироптотических клеток в каждой группе в пункте (А) было построено на графике и подвергнуто статистическому анализу. Для анализа статистической значимости был использован двусторонний ANOVA. Данные представляли собой три независимых эксперимента и были представлены как средства ± SD. ***P &lt; 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66912/66912fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.</a>

В данной статье описана идентификация пироптотических клеток с помощью проточной цитометрии после двойного окрашивания антителами против N-концевого фрагмента куриного GSDME (chGSDME-NT) и йодида пропидия (PI).

Pyroptosis is an inflammatory type of programmed cell death predominantly driven by the formation of plasma membrane pores by the N-terminus generated ...

examination-of-pyroptosis-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Иммунология и инфекции

Мы представляем проточной цитометрии на основе метода для изучения Т-клеточного...

Экспертиза тимуса позитивной и негативной селекции с помощью проточной цитометрии

Это видео демонстрирует проточную цитометрию для измерения поглощения микроглией флуоресцентных биочастиц после интравитреальной доставки в глаз мыши. Проточная цитометрия обнаруживает живые клетки, экспрессирующие CD11b, и отличает клетки фагоцитарной микроглии, проявляющие зеленую флуоресценцию, от других миелоидных клеток, включая моноциты, экспрессирующие Ly6C, и нейтрофилы, экспрессирующие Ly6G.

Измерение поглощения микроглией интравитреально доставляемых флуоресцентных частиц с помощью проточной цитометрии

Поколение ортотопической крысиной модели плевральной мезотелиомы по злокачественной имплантации II-45 мезотелиомы клеток в плевральной полости иммунокомпетентных крыс представлены. Метод цитометрии потока для анализа семь подмножеств иммунных клеток в этих животных из 25 мкл пробы крови также описывается.

Ортотопическая Имплантация и периферической иммунной Мониторинг сотовый в модели II-45 Сингенная Крыса мезотелиомы

Представленные здесь простой метод для изоляции и потока цитометрии анализа глиомы инфильтрирующие мононуклеарных клеток периферической крови, что дает время зависит от количественных данных о количестве и состоянии активации иммунных клеток, входящих в ранней микросреду опухоли головного мозга.

Выделение и проточной цитометрии анализ глиомы инфильтрирующие мононуклеарных клеток периферической крови

Микроглии фагоцитоза имеет решающее значение для поддержания гомеостаза тканей и недостаточной фагоцитарной функции были замешаны в патологии. Тем не менее, оценки функции микроглии в естественных условиях является технически сложной задачей. Мы разработали простой, но надежный метод для точного мониторинга и количественной оценки фагоцитарной потенциала микроглии в физиологической обстановке.

Оценка сетчатке микроглии фагоцитарной функции<em&gt; В Vivo</em&gt; С использованием анализа проточной цитометрии на основе

Состояние здоровья легкого отражается типом и числом иммунных клеток, которые присутствуют в бронхиолах легких. Мы описываем метод бронхоальвеолярного лаважа, который позволяет изолировать и исследовать неадгезивные клетки и растворимые факторы из нижних дыхательных путей мышей.

Бронхоальвеолярное спазмы легких у мышей для анализа воспалительной клеточной инфильтрации

Мы описываем обнаружения NLRP3 Инфламмасома активации на основе сотовой с помощью флуоресцентной микроскопии и пятнать для активно caspase-1 и адаптер, ASC. Лактатдегидрогеназа выпуска пробирного представлен для обнаружения pyroptotic лизиса на основе населения. Эти методы могут быть адаптированы для изучения многих аспектов биологии Инфламмасома.

Обнаружение Инфламмасома активации и Pyroptotic клеточной гибели в мышиных макрофагов, костного мозга, полученных

Апоптоз может быть охарактеризован проточно-цитометрическим анализом ранних и поздних апоптотических биомаркеров. Клеточная линия рака шейки матки, SiHa, была проанализирована на биомаркеры апоптоза после лечения актиномицином D с использованием настольного проточного цитометра.

Проточный цитометрический анализ биомаркеров апоптоза в клетках рака шейки матки SiHa, обработанных актиномицином D

Этот протокол описывает эффективный метод диссоциации мокроты на одноклеточную суспензию и последующую характеристику клеточных подмножеств на стандартных проточных цитометрических платформах.

Анализ мокроты с контролем качества с помощью проточной цитометрии

Содержание гидропероксида липидов является наиболее часто используемым индикатором гибели ферроптозных клеток. В данной статье представлен пошаговый анализ содержания гидропероксида липидов в клетках с помощью проточной цитометрии при индукции ферроптоза.

Выявление ферроптотического фенотипа медуллобластомы

Изучите метод проточной цитометрии для исследования пироптоза в птичьих клетках с использованием двойного окрашивания антителами против chGSDME-NT и йодида пропидия. Этот подход позволяет точно количественно определять пироптотические клетки.

Исследование пироптоза методом проточной цитометрии

Больше видео