Исследование пироптоза методом проточной цитометрии
31 мая 2024 г.
В данной статье описана идентификация пироптотических клеток с помощью проточной цитометрии после двойного окрашивания антителами против N-концевого фрагмента куриного GSDME (chGSDME-NT) и йодида пропидия (PI).
Цель нашей исследовательской группы состоит в том, чтобы определить, подвергаются ли птичьи клетки пироптозу, подобному пироптозу клеток млекопитающих. Кроме того, мы стремимся определить пироптоз с помощью более точных и простых методов. Многие гены у птиц значительно отличаются от генов у млекопитающих, что затрудняет использование реагентов, обычно используемых в исследованиях клеток млекопитающих, для исследования гибели птичьих клеток.
Таким образом, исследования гибели птичьих клеток намного сложнее, чем исследования человеческих или мышиных клеток. Мы используем характерные поры плазматической мембраны в пироптотических клетках, образованные N-концевыми фрагментами гасдермина, для разработки стратегии определения пироптоза на основе проточной цитометрии. С помощью этого нового подхода мы наблюдали возникновение пироптоза, вызванного инфекционной бурсальной болезнью, в клетках птиц.
В отличие от предыдущих методов, таких как вестерн-блоттинг или анализ АСМ, наш протокол способен точно количественно оценить процент пироптотических клеток по двум параметрам одновременно: образованию пор плазматической мембраны и разрыву плазматической мембраны, что способствует дифференцировке клеток с пироптозом от других форм клеточной гибели.
Обзор
В данной статье исследуется, подвергаются ли клетки птиц пироптозу по аналогии с клетками млекопитающих, с использованием проточной цитометрии для их идентификации. В исследовании применяется двойное окрашивание антителами к N-терминальному фрагменту GSDME курицы и провидиумйодидом.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Биология птиц
Теоретическая часть
- Исследование гибели клеток птиц затруднено из-за генетических различий с млекопитающими.
- Пироптоз представляет собой форму программируемой гибели клеток, характеризующуюся образованием пор в плазматической мембране.
- Понимание механизмов пироптоза у птиц может дать представление о процессах гибели клеток.
- Существующие методы изучения гибели клеток млекопитающих не применимы напрямую к клеткам птиц.
Цель исследования
- Определить, проявляют ли клетки птиц пироптоз, аналогичный пироптозу клеток млекопитающих.
- Разработать более точный и простой метод идентификации пироптотических клеток.
- Углубить понимание механизмов гибели клеток птиц.
Используемые методы
- Проточная цитометрия для идентификации клеток.
- Двойное окрашивание антителами к chGSDME-NT и пропидия иодидом.
- Наблюдение за характеристиками пироптотических клеток.
- Анализ пироптоза в клетках птиц, индуцированного вирусом инфекционного бурситa.
Основные результаты
- Идентификация пироптотических клеток у видов птиц.
- Успешное применение проточной цитометрии для изучения гибели клеток птиц.
- Демонстрация пироптоза, вызванного инфекционным бурситом.
- Разработка нового подхода к изучению пироптоза у птиц.
Выводы
- Клетки птиц могут подвергаться пироптозу, аналогично клеткам млекопитающих.
- Разработанный метод предоставляет надежный способ идентификации пироптотических клеток.
- Данное исследование вносит вклад в понимание механизмов гибели клеток птиц.
Часто задаваемые вопросы
Промышленное значение для руководителей
Количественная идентификация пироптоза в клетках птиц с помощью проточной цитометрии восполняет критический пробел в разграничении воспалительной гибели клеток и других ее форм, особенно в тех случаях, когда генетическая дивергенция ограничивает перенос методов анализа между видами. Этот двухпараметрический подход повышает достоверность прогнозов при анализе путей гибели клеток, что способствует раннему обнаружению и механистическому снижению рисков при разработке биопрепаратов и вакцин. Данный метод позволяет принимать обоснованные решения по формированию портфеля препаратов за счет выяснения механизмов гибели клеток в релевантных моделях заболеваний птиц.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Обеспечивает возможность точного изучения путей пироптоза в немлекопитающих системах.
- Поддерживает функциональную валидацию мишеней путем дифференциации пироптоза от других форм гибели клеток.
- Повышает прогностическую уверенность при применении специфических для данных путей вмешательств в моделях заболеваний птиц.
Скрининг и разработка анализа
- Облегчает подготовку валидированных систем клеток птиц для последующих рабочих процессов скрининга.
- Обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые и количественные результаты с помощью двухпараметрической проточной цитометрии.
- Позволяет проводить надежную оценку соединений или вмешательств, направленных на пироптоз.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует релевантным моделям заболеваний у птиц для разработки трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации в ветеринарных и зоонозных исследованиях.
- Обеспечивает механистическое снижение рисков при выборе кандидатов в программах, ориентированных на птиц.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Этот метод двухпараметрической проточной цитометрии интегрируется на ранних этапах поиска и разработки анализов, связывая валидацию мишеней и выбор доклинических моделей для исследования гибели клеток птиц.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез и уточнению путей пироптоза в генетически различных системах.
- Скрининг: обеспечивает готовность и воспроизводимость анализа для количественной оценки гибели клеток.
- Аналитика: позволяет проводить измерения по двум маркерам (chGSDME-NT и PI) для сравнения различных типов гибели клеток.
- Трансляционные исследования: обеспечивает согласованность с релевантными моделями заболеваний на птицах для обеспечения непрерывности биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: создает воспроизводимую платформу для количественного определения гибели клеток в рамках различных исследовательских программ по птицам.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при анализе путей гибели клеток.
- Операционная ценность: стандартизирует и масштабирует количественную оценку пироптоза в системах птиц.
- Стратегическая ценность: служит основанием для принятия решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go) и снижает биологические риски на поздних этапах в портфелях, ориентированных на птиц.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию с учетом рисков, а также продвижение моделей заболеваний и методов терапии птиц.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области проточной цитометрии и биологии клеток птиц.
- Необходим доступ к валидированным антителам и аналитической инфраструктуре для цитометрии.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости двухпараметрического анализа.
- Может потребоваться адаптация для других видов птиц или типов клеток в зависимости от генетической дивергенции.
- Зависит от наличия соответствующих клеточных линий и вирусных моделей заболеваний.
