Использование модифицированных синтетических олигонуклеотидов для анализа ферментов, метаболизирующих нуклеиновые кислоты
5 июля 2024 г.
Здесь представлен протокол анализа ферментов, метаболизирующих нуклеиновые кислоты, с использованием примеров ферментов лигазы, нуклеазы и полимеразы. В анализе используются флуоресцентно меченые и немеченые олигонуклеотиды, которые могут быть объединены для образования дуплексов, имитирующих повреждения РНК и/или ДНК или промежуточные пути, что позволяет охарактеризовать поведение фермента.
Итак, моя исследовательская группа, мы действительно заинтересованы в ферментах, участвующих в репликации и репарации ДНК. В частности, мы изучаем ферменты экстремофильных микроорганизмов, а также патогенов, потому что хотим понять, как эти ферменты позволяют этим организмам выживать в условиях окружающей среды. Нас интересует как биологическая функция ферментов, так и биотехнологическое применение.
Итак, мы много работаем с ДНК и РНК-лигазами, и недавно мы установили роль минимального типа ДНК-лигазы, которая, по-видимому, транспортируется наружу бактериальной клетки. И мы определили, что это играет роль в образовании биопленки у патогена Neisseria gonorrhoeae. Кроме того, совместно с нашими коллегами из ArcticZymes мы охарактеризовали новую лигазу РНК-ДНК, которая способна прикреплять адаптеры ДНК к любому концу фрагмента РНК.
Поэтому наши сотрудники из ArcticZymes, которые также внесли свой вклад в этот протокол, характеризуют различные ферменты, метаболизирующие ДНК и РНК, которые имеют потенциальное применение в молекулярной биологии. Таким образом, они используют этот тип протокола в качестве первого шага к пониманию спектра активности этих ферментов и их сравнительному сравнению с тем, что уже доступно на рынке. Протокол предлагает более простую и безопасную альтернативу для анализа ферментов, метаболизирующих нуклеиновые кислоты, по сравнению с использованием субстратов, меченных радиоактивными веществами.
Флуоресцентно меченные субстраты ДНК или РНК делают наш подход более эффективным, поскольку мы можем смешивать и сочетать олигонуклеотиды для создания различных субстратов. Так что на данный момент мы действительно сосредоточены на понимании биологической функции некоторых новых нуклеаз, которые мы обнаружили в экологическом геноме Антарктики. Эти нуклеазы имеют гомологи у других экстремофильных организмов, и поэтому мы пытаемся понять, какую роль они играют в том, чтобы позволить этим микробам выжить.
Мы также очень заинтересованы в активности некоторых из наших новых ферментов на неприродных аналогах нуклеиновых кислот и их потенциальном использовании в рамках набора инструментов молекулярной биологии с неестественными субстратами ДНК и РНК.
Обзор
В данной статье представлен протокол анализа ферментов, метаболизирующих нуклеиновые кислоты, с основным вниманием к лигазам, нуклеазам и полимеразам. В методе анализа используются флуоресцентно меченные и немеченные олигонуклеотиды для создания дуплексов, имитирующих повреждения РНК и ДНК, что позволяет охарактеризовать поведение ферментов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биохимия
- Молекулярная биология
- Ферментативные анализы
Теоретическая часть
- Исследования ферментов, участвующих в репликации и репарации ДНК.
- Особое внимание уделяется экстремофильным микроорганизмам и патогенам.
- Изучение биологических функций и биотехнологического применения этих ферментов.
- Изучение ДНК- и РНК-лигаз и их роли в выживании бактерий.
Цель исследования
- Для характеристики ферментов, метаболизирующих нуклеиновые кислоты.
- Для изучения роли ДНК-лигаз в формировании биопленок.
- Для поиска новых РНК-ДНК-лигаз для применения в биотехнологии.
Используемые методы
- Разработка анализа с использованием флуоресцентно меченных олигонуклеотидов.
- Характеристика поведения фермента посредством образования дуплексов.
- Сотрудничество с компанией ArcticZymes по характеристике ферментов.
- Исследование транспорта ферментов в бактериальных клетках.
Основные результаты
- Определение роли минимальной ДНК-лигазы в формировании биопленок.
- Характеристика новой РНК-ДНК-лигазы.
- Понимание того, как экстремофильные микроорганизмы выживают в сложных условиях окружающей среды.
- Потенциальные биотехнологические применения исследованных ферментов.
Выводы
- Данное исследование расширяет понимание ферментов, метаболизирующих нуклеиновые кислоты.
- Полученные результаты могут привести к новым биотехнологическим применениям.
- Для изучения полного потенциала этих ферментов необходимы дальнейшие исследования.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Методы анализа с использованием модифицированных синтетических олигонуклеотидов позволяют проводить быстрый бессвечной анализ ферментов, метаболизирующих нуклеиновые кислоты, что способствует валидации мишеней на ранних этапах и снижению механистических рисков в биофармацевтических исследованиях и разработках.&D. Флуоресцентное мечение и адаптация субстратов позволяют проводить высокопроизводительный количественный анализ специфичности ферментов, предпочтений по кофакторам и совместимости субстратов. Эти возможности оптимизируют оценку новых лигаз, нуклеаз и полимераз, ускоряя отбор перспективных кандидатов из портфеля и снижая биологическую неопределенность в процессах разработки и поиска.
Стратегические приложения в биофармацевтических исследованиях&D
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет исследовать субстратную специфичность фермента и требования к кофакторам для функциональной валидации мишени.
- Способствует снижению механистических рисков путем изучения активности фермента в отношении поврежденных или ненатуральных нуклеиновых кислот.
- Облегчает сравнительный анализ новых ферментов с установленными стандартами для приоритизации портфеля.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает использование стандартизированных модульных субстратов для воспроизводимого анализа ферментативной активности.
- Обеспечивает количественные результаты на основе флуоресценции, подходящие для масштабируемых рабочих процессов скрининга.
- Исключает работу с радиоактивными веществами, что повышает эксплуатационную безопасность и доступность метода для различных лабораторий.
Трансляционные и доклинические исследования
- Позволяет оценивать ферментативную активность на синтетических аналогах нуклеиновых кислот или аналогах, имеющих значение для заболевания, при условии соответствующего подбора субстрата.
- Обеспечивает преемственность от этапа поиска до доклинической валидации за счет использования надежных, переносимых форматов анализа.
- Способствует принятию обоснованных с учетом рисков решений о дальнейшем продвижении проекта благодаря количественной характеристике ферментов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данные анализы на основе олигонуклеотидов позволяют проводить характеристику ферментов на стыке этапов первичного скрининга, идентификации ведущих соединений и доклинических исследований, обеспечивая итеративную проверку гипотез и механистическую валидацию.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез о функциях ферментов и совместимости субстратов.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные данные для сравнительного анализа ферментов.
- Аналитика: позволяет точно измерять активность лигирования, деградации и связывания с помощью количественного определения флуоресценции.
- Трансляционные исследования: позволяет адаптировать метод под синтетические субстраты или субстраты, имеющие значение при конкретных заболеваниях, для достижения соответствия с доклиническими данными.
- Повторное использование в масштабах предприятия: предоставляет гибкую платформу без использования радиоактивных изотопов, применимую к различным классам ферментов и исследовательским задачам.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при валидации ферментативной мишени.
- Эксплуатационное значение: Повышает уровень стандартизации, воспроизводимости и безопасности за счет исключения радиоактивных материалов.
- Стратегическая ценность: Повышает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go decision) и эффективность использования капитала на ранних стадиях НИОКР&Г.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию мишеней-ферментов и наборов инструментов для последующей разработки с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в дизайне олигонуклеотидов и оптимизации ферментативных анализов.
- Необходим доступ к системе визуализации PAGE с флуоресцентной детекцией и стандартной инфраструктуре для молекулярно-биологических исследований.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов подготовки субстратов и анализа данных.
- Допускается адаптация к различным классам ферментов и модификациям субстратов в зависимости от доступности коммерческих олигонуклеотидов.
- Возможны ограничения, обусловленные сложностью дизайна субстратов или совместимостью фермента с синтетическими аналогами.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:24
Assembling and Annealing Nucleic Acid Duplexes for Characterizing Enzymatic DNA Processing with Modified Oligonucleotides
3:54
Urea‐Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE) for Probing DNA Enzyme Activities Employing Commercial Oligonucleotides
