Системы AAV и мышиные модели для исследования эктопической экспрессии Neurod1 в трансдуцированных клетках при подостром и хроническом периоде постишемического инсульта
29 ноября 2024 г.
Этот протокол описывает вирус-опосредованную эктопическую экспрессию Neurod1 после кортикального ишемического инсульта. Neurod1 доставляется (1) с помощью системы Cre-Flex AAV мышам дикого типа во время подострой фазы после инсульта (7 дней) и (2) с использованием одного вектора AAV у мышей условного репортера во время хронической фазы после инсульта (21 день).
Мы изучаем AAV-опосредованную эктопическую экспрессию нейрогенных транскрипционных факторов в качестве потенциального лечения ишемического инсульта. Наша цель состоит в том, чтобы выяснить, увеличивает ли экспрессия Neurod1 в GFAP-экспрессирующих клетках во время подострой и хронической фаз после инсульта трансдуцированные нейроны и коррелирует с улучшением двигательных функций. Наши исследования показали, что промотор GFAP более активен в медиальной префронтальной коре, чем в моторной коре, что указывает на то, что трансдуцированные клетки по-разному реагируют на конкретные промоторы.
Таким образом, терапия с использованием нейрогенных факторов транскрипции должна быть адаптирована к целевой области мозга. Текущие проблемы включают вариабельность размеров инсультных поражений из-за таких переменных, как скорость инъекций ET-1 и эффективность трансдукции между областями мозга. Титры AAV и тропизм в областях мозга и у мышей могут влиять на эффективность трансдукции, влияя на клеточную оценку экспрессии эктопического Neurod1 после инсульта.
Основная проблема при преобразовании астроцитов в нейроны заключается в том, чтобы отличить перепрограммированные нейроны от уже существующих. Наша лаборатория стремится подтвердить, что это перепрограммирование происходит in vivo, путем разработки новых инструментов. В конечном счете, мы стремимся понять, как эктопическая экспрессия нейронального транскрипционного фактора способствует восстановлению у животных с поврежденным мозгом.
Для начала извлеките животное под наркозом из камеры и положите его на чистую поверхность. После очистки хирургической области мыши поместите ее нос в стереотаксический носовой конус и стабилизируйте череп с помощью ушных планок. С помощью лезвия скальпеля номер 10 сделайте вертикальный разрез параллельно сагиттальной плоскости от середины глаз до теменной кости.
Затем аккуратно втяните кожу, чтобы обнажить череп. Затем используйте ватную палочку, чтобы разрушить фасцию на черепе и дать черепу высохнуть, чтобы полностью обнажить брегму. С помощью высокоскоростного стереотаксического сверла просверлите три отверстия для заусенцев по координатам в правой сенсорно-моторной коре.
Затем замените дрель шприцем 26-го калибра, оснащенным иглой длиной 0,375 дюйма. Загрузите в шприц 1,5 мкл 400 микромолярного раствора эндотелина-1, растворенного в стерильном PBS. Выпустите небольшой объем эндотелина-1, чтобы наблюдать за каплей на кончике иглы, обеспечивая хороший поток.
Опустите кончик иглы мимо черепа в среднее отверстие для заусенцев, не прокалывая твердую мозговую оболочку. После выравнивания опустите иглу на один миллиметр в мозг. Используя шприц Гамильтона, дозируйте по 0,1 микролитра за раз и подождите одну минуту, прежде чем вводить следующие 0,1 микролитра.
Чтобы предотвратить закупорку иглы между инъекциями и после них, выпускайте небольшой объем эндотелина-1 до тех пор, пока на кончике иглы не появится капля. С помощью стерильной ватной палочки перед инъекцией сотрите избыток эндотелина-1. Наконец, зашите вышележащую кожу на черепе с помощью стерильного шва 4-0, чтобы закрыть рану.
После обезболивания мыши, обработанной эндотелином-1, перенесите мышь в стереотаксическую рамку. С помощью хирургических ножниц разрежьте швы на ране. С помощью щипцов удалите струп и втяните кожу, чтобы обнажить череп.
Затем используйте стерильную ватную палочку, чтобы высушить поверхность черепа и найти отверстия от заусенцев. Установите манипуляторные рычаги стереотаксического аппарата. Поместите иглодержатель со шприцем 26-го калибра с иглой длиной 0,375 дюйма.
Теперь загрузите в шприц 3,4 микролитра раствора AAV. Опустите кончик иглы мимо черепа в первое, самое переднее отверстие для заусенца. Следите за тем, чтобы игла не проколола твердую мозговую оболочку, затем опустите ее на один миллиметр в мозг.
Используя шприц Гамильтона, введите один микролитр раствора AAV, дозируя 0,1 микролитра за раз, как было показано ранее. Затем зашить вышележащую кожу на черепе, чтобы закрыть рану, используя шов из полиэстера Polysorb 4-0. Извлеките мышь из стереотаксической рамки и перенесите ее в чистую, предварительно нагретую клетку для животных в зоне восстановления.
Обзор
В данном исследовании изучается эктопическая экспрессия нейрогенного транскрипционного фактора Neurod1 после ишемического инсульта в коре головного мозга с использованием доставки с помощью AAV. Протокол включает две фазы: подострую (7 дней после инсульта) на мышах дикого типа и хроническую (21 день после инсульта) на кондиционных репортерных мышах. Цель работы — оценить, способствует ли экспрессия Neurod1 восстановлению нейронов и улучшению двигательной функции.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Генная терапия
- Восстановление после инсульта
Теоретические сведения
- Ишемический инсульт приводит к гибели нейронов и возникновению функционального дефицита.
- Перепрограммирование нейронов обладает потенциалом для восстановления функций.
- В данном контексте для доставки генов используются векторы AAV.
- Время проведения вмешательства может влиять на терапевтические результаты.
Цель исследования
- Изучение влияния экспрессии Neurod1 на регенерацию нейронов в моделях после инсульта.
- Исследование корреляции между экспрессией Neurod1 и восстановлением двигательной функции.
- Оценка вариабельности ответа в зависимости от метода и сроков доставки гена.
Используемые методы
- Для доставки Neurod1 использовались AAV-векторы через систему Cre-Flex.
- В качестве биологической модели использовались мыши дикого типа и мыши с условным репортером после перенесенного инсульта.
- Исследование сфокусировано на различных временных точках (7 дней и 21 день после инсульта).
- Экспериментальные протоколы включают точные хирургические процедуры для инъекции вектора.
- Были отмечены сложности в достижении стабильной эффективности трансдукции в различных областях мозга.
Основные результаты
- Экспрессия Neurod1 в астроцитах способствовала увеличению числа трансдуцированных нейронов.
- Улучшение двигательных функций коррелировало с временем экспрессии Neurod1.
- Наблюдалась вариабельность экспрессии генов в зависимости от систем доставки AAV.
- Валидация перепрограммирования in-vivo остается сложной задачей.
Выводы
- Исследование демонстрирует потенциал Neurod1 в содействии восстановлению после инсульта.
- Понимание сроков и метода доставки гена может оптимизировать терапевтические стратегии.
- Данные этого исследования могут лечь в основу будущих подходов к регенерации нейронов и реабилитации после инсульта.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Эктопическая экспрессия нейрогенных факторов транскрипции, опосредованная AAV, позволяет точно исследовать нейрональное перепрограммирование в областях мозга после инсульта, что способствует валидации мишеней для регенеративной терапии. Данная платформа решает проблему региональной специфичности активности промоторов и эффективности трансдукции, повышая прогностическую достоверность на ранних этапах разработки методов нейрорегенерации. Стандартизированные системы AAV обеспечивают воспроизводимую оценку изменений клеточной судьбы под воздействием факторов транскрипции, что напрямую влияет на отбор приоритетных стратегий восстановления ЦНС.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Обеспечивает функциональную валидацию нейрогенных факторов транскрипции в релевантных моделях заболеваний in vivo.
- Способствует снижению механистических рисков путем уточнения региональных и промотор-специфических ответов на доставку генов.
- Предоставляет платформу для проверки гипотез в области нейронального репрограммирования после повреждения.
- Повышает прогностическую уверенность при выборе мишеней из факторов транскрипции для дальнейшей разработки.
Скрининг и разработка анализа
- Создает стандартизированные системы на основе AAV для воспроизводимой эктопической экспрессии генов в моделях ЦНС.
- Обеспечивает количественную оценку числа трансдуцированных нейронов и экспрессии репортерного гена.
- Обеспечивает готовность анализа для оценки эффективности нейрогенных факторов в различных областях мозга.
- Предоставляет масштабируемые протоколы, адаптируемые к различным линиям мышей и временным рамкам экспериментов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует релевантным моделям ишемического инсульта для трансляционного поиска биомаркеров.
- Обеспечивает непрерывность процесса от стадии открытия методов перепрограммирования до доклинической валидации функционального восстановления.
- Поддерживает принятие обоснованных решений о продвижении с учетом рисков путем количественной оценки состояния нейронов после вмешательства.
- Решает трансляционные задачи, связанные с регион-специфической доставкой генов и клеточным перепрограммированием.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данная платформа эктопической экспрессии на основе AAV объединяет этапы от раннего поиска до доклинической валидации, что позволяет проводить итерационную проверку гипотез и снижение механистических рисков в рамках разработки методов восстановления ЦНС.
- Открытия в биологии: Обеспечивает проверку нулевой гипотезы об эффективности нейрогенных факторов in vivo.
- Скрининг: Обеспечивает получение количественных, воспроизводимых результатов для сравнения активности промоторов и эффективности трансдукции.
- Аналитика: Позволяет измерять количество трансдуцированных нейронов и экспрессию генов в конкретных областях.
- Трансляционные исследования: Связывает результаты фундаментальных открытий с доклиническими моделями восстановления после инсульта.
- Корпоративное использование: Предлагает модульную, адаптируемую систему для различных программ по нейрорегенерации.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую уверенность при выборе мишеней и углубляет понимание механизмов нейронального перепрограммирования.
- Операционная ценность: стандартизирует протоколы доставки и количественного анализа генов для обеспечения воспроизводимости результатов между различными исследованиями.
- Стратегическая ценность: служит основой для принятия решений о продолжении или прекращении разработок путем уточнения результатов, специфичных для конкретных областей и промоторов.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию кандидатов в нейрогенные факторы для восстановления ЦНС с учетом оценки рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт проведения стереотаксических операций и работы с векторами AAV.
- Необходим доступ к инфраструктуре для количественного имиджинга и анализа судьбы клеток.
- Требуется межгрупповая стандартизация скорости инъекций и выбора промотора.
- Необходимо учитывать вариабельность эффективности трансдукции в различных областях мозга и линиях мышей.
- Для точной интерпретации результатов крайне важно четко различать перепрограммированные и ранее существовавшие нейроны.
