Робастное обнаружение амплификации генов в образцах, инспирированных формалином, с помощью флуоресцентной гибридизации in situ
12 июля 2024 г.
Этот протокол представляет собой воспроизводимый метод визуализации амплификации генов в образцах тканей, встроенных в парафин с фиксированным формалином (FFPE).
Амплификация онкогенов является важнейшим фактором развития рака. Цитогенетическая характеристика образцов FFPE является экономически эффективным способом изучения амплификации онкогенов. Мы представляем надежные и исчерпывающие инструкции по исследованию фокальной амплификации генов и образцов FFPE.
Изучая паттерн сигнала FISH, становится однозначно ясно, усиливается ли локус гена и каким образом. Обнаружено, что онкогены, амплифицируемые в виде дополнительной хромосомной ДНК, преобладают при раке человека, таком как рак легких, молочной железы и мозга. Секвенирование всего генома и FISH являются наиболее широко используемыми методами обнаружения внехромосомной ДНК.
Применение FISH к тканям FFPE является сложной задачей, поскольку артефакты сшивания и фоновая автофлуоресценция часто ухудшают качество данных. Наш протокол включает в себя оптимизированные процедуры, включая экстракцию и разложение белка, методы термоденатурации и автофлуоресцентного гашения для улучшения качества данных во время FISH на образцах FFPE, что даст ценную информацию о прогрессировании рака у пациентов. Мы будем изучать молекулярные функции внехромосомной ДНК и то, как раковые клетки поддерживают внехромосомную ДНК.
В конечном счете, мы стремимся устранить их для лечения рака.
Обзор
В данном протоколе представлен воспроизводимый метод визуализации амплификации генов в образцах тканей, фиксированных в формалине и залитых парафином (FFPE). Используя методы FISH, исследователи могут эффективно изучать амплификацию онкогенов, которая является значимым фактором прогрессирования рака.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Онкология
- Генетика
- Цитогенетика
Теоретические основы
- Амплификация онкогенов является критическим фактором развития рака.
- Образцы FFPE обычно используются для цитогенетической характеристики.
- Методы FISH необходимы для обнаружения амплификации генов.
- К основным проблемам относятся артефакты сшивания и аутофлуоресценция в тканях FFPE.
Цель исследования
- Предоставить оптимизированные процедуры проведения FISH на образцах FFPE.
- Исследовать молекулярные функции внехромосомной ДНК в раковых клетках.
- Повысить качество данных и углубить понимание механизмов прогрессирования рака.
Используемые методы
- Подготовка образцов и предварительная обработка предметных стекол с FFPE-материалом.
- Экстракция и переваривание белков с использованием протеиназы K.
- Методы гибридизации FISH и визуализации.
- Анализ данных с использованием алгоритмов максимальной 3D-проекции и деконволюции.
Основные результаты
- Отчетливые паттерны сигналов FISH, наблюдаемые в образцах трижды отрицательного рака молочной железы.
- Образцы с HER2-положительным статусом демонстрировали большое количество сигналов FISH, указывающее на амплификацию гена.
- В некоторых ядрах были выявлены кластеры дополнительных хромосомных ДНК-хабов.
- Оптимизированные методы позволили повысить качество данных FISH в тканях, фиксированных в формалине и залитых парафином (FFPE).
Выводы
- Данный протокол расширяет возможности изучения амплификации онкогенов при раке.
- Совершенствование методов может привести к более глубокому пониманию механизмов развития рака.
- Будущие исследования могут быть сосредоточены на удалении внехромосомной ДНК для лечения рака.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Надежное выявление амплификации генов в образцах FFPE с помощью метода FISH отвечает критической потребности в достоверной оценке онкогенов в архивных клинических материалах. Эта возможность повышает прогностическую уверенность при валидации мишеней и поддерживает принятие решений с учетом рисков в ключевых точках открытия и трансляционных исследований. Стандартизированные рабочие процессы FISH в тканях FFPE обеспечивают согласованную оценку амплификации генов, что напрямую влияет на приоритетность портфеля онкологических препаратов.
Стратегические области применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую визуализировать события амплификации генов в клинически значимых контекстах тканей.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишени путем подтверждения статуса амплификации онкогенов в образцах опухоли.
- Способствует снижению механистических рисков за счет разграничения амплификации, вызванной ecDNA, и хромосомных событий.
- Повышает прогностическую достоверность при последующей проверке терапевтических гипотез.
Скрининг и разработка анализа
- Предлагает стандартизированный цитогенетический анализ для количественного определения амплификации генов в образцах FFPE.
- Обеспечивает воспроизводимость и сопоставимость результатов в различных архивах тканей.
- Предоставляет количественные данные визуализации, подходящие для сравнительного анализа анализа и валидации платформы.
- Позволяет проводить надежный скрининг потенциальных биомаркеров в рамках исследовательских программ в области онкологии.
Трансляционные и доклинические исследования
- Обеспечивает соответствие методов детекции амплификации генов моделям тканей, релевантным заболеванию, для обеспечения трансляционной преемственности.
- Поддерживает стратификацию пациентов на основе биомаркеров в доклинических исследованиях.
- Способствует продвижению онкологических препаратов с учетом рисков на основе подтвержденного статуса амплификации.
- Предоставляет понимание механизмов резистентности к терапии, связанной с экстрахромосомной ДНК (ecDNA) при прогрессировании рака.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный протокол FISH интегрируется в континуум «от открытия к трансляции», обеспечивая надежную оценку амплификации генов в образцах FFPE, что связывает этапы раннего поиска, разработки анализа и рабочие процессы трансляционных исследований.
- Открытия в биологии: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей путем подтверждения амплификации онкогенов в архивных тканях.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные результаты FISH для стандартизации анализа и оценки соединений.
- Аналитика: предоставляет изображения высокого разрешения и количественный анализ сигнала для сравнительных исследований.
- Трансляционные исследования: обеспечивает непрерывность валидации биомаркеров от этапа открытия до доклинических моделей с использованием клинически значимых образцов.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает повторно используемый стандартизированный рабочий процесс для выявления амплификации генов в рамках онкологических программ.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования и снижает неопределенность механизмов при валидации мишеней.
- Практическая ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость анализов амплификации генов в тканях, фиксированных в формалине и залитых парафином (FFPE).
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет обеспечения надежной оценки биомаркеров.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритезацию с учетом рисков и продвижение онкологических активов на основе валидированных данных об амплификации.
Особенности реализации
- Для оптимального сбора данных требуются экспертные знания в области цитогенетики и флуоресцентной визуализации.
- Необходим доступ к высококачественным платформам визуализации и аналитическому программному обеспечению для количественного определения сигнала.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов подготовки образцов и визуализации.
- В зависимости от характеристик образцов может потребоваться адаптация метода для различных типов тканей или мишеней-онкогенов.
- Потенциальные ограничения включают автофлуоресценцию и артефакты сшивания, характерные для образцов, фиксированных формалином и залитых парафином (FFPE).
