Достижения в технологии производства органоидов крупного рогатого скота с использованием монослойных интерфейсов тонкого и толстого кишечника
14 июня 2024 г.
В этом исследовании представлен протокол создания 2D-монослоев кишечника крупного рогатого скота из органоидов, обеспечивающий улучшенный доступ к изучению взаимодействий хозяина и патогена. Он включает в себя методы оценки целостности и функциональности мембраны, усовершенствование моделей in vitro , которые имитируют физиологию желудочно-кишечного тракта крупного рогатого скота. Такой подход обещает значительные биомедицинские и сельскохозяйственные преимущества, в том числе усовершенствованные стратегии лечения.
Целью наших исследований является создание надежных методов создания основных кишечных монослойных интерфейсов, полученных из органоидов тонкого и толстого кишечника крупного рогатого скота. Мы использовали мультимодальный аналитический подход для подтверждения формирования функционального эпителиального барьера в пределах установленных монослоев. В отличие от трехмерных моделей, двухмерные монослои обеспечивают открытую, доступную световую поверхность, имеющую решающее значение для изучения взаимодействий патогенов хозяина.
Эти монослои, отражающие кишечник in vivo с несколькими клеточными линиями, теперь обеспечивают индивидуальные протоколы для исследования патогенов в конкретных отделах кишечника, таких как тонкие и толстые кишечные ниши. Наше исследование выявило оптимизированные условия культивирования для создания и поддержания 2D-монослоев из клеток крупного рогатого скота и органоидов толстого кишечника. Мы подтвердили формирование функционального эпителиального барьера в этих монослоях с помощью трансэпителиальных электрических регистрантов и анализов парацеллюлярной проницаемости, а также методов иммуноцитохимического окрашивания.
Наш протокол восполнил пробел в исследованиях, сосредоточившись на недостатке монослойных моделей кишечных органоидов крупного рогатого скота. Эти модели были хорошо изучены на мышах и людях, однако крупный рогатый скот, который является основным резервуаром кишечных патогенов с серьезными последствиями для общественного здравоохранения, не был должным образом изучен. В наших исследованиях установлена и охарактеризована 2D система монослойного культивирования крупного рогатого скота.
Этот инновационный инструмент позволяет исследовать нормальные и болезненные состояния физиологии кишечника крупного рогатого скота с потенциальными применениями в биомедицинских и трансляционных исследованиях, имеющих значение для общественного здравоохранения.
Обзор
В данном исследовании представлен протокол создания двухмерных (2D) монослоев кишечника крупного рогатого скота из органоидов, что облегчает изучение взаимодействий между хозяином и патогеном. Подход включает методы оценки целостности и функциональности мембраны, что позволяет усовершенствовать модели in vitro, имитирующие физиологию желудочно-кишечного тракта скота.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология
- Биомедицинские исследования
Теоретические сведения
- Монослои, полученные из кишечных органоидов, были подробно изучены на мышах и людях.
- Крупный рогатый скот является основным резервуаром кишечных патогенов, что имеет серьезные последствия для общественного здравоохранения.
- Существующим моделям не хватает достаточного изучения физиологии кишечника КРС.
- 2D-монослои обеспечивают доступную поверхность для изучения взаимодействий между хозяином и патогеном.
Цель исследования
- Разработать методы получения монослоев кишечника крупного рогатого скота из органоидов.
- Создать модели, отражающие среду кишечника in vivo.
- Оптимизировать условия культивирования для поддержания 2D-монослоев.
Используемые методы
- Покрытие вставок для культура клеток внеклеточным матриксом.
- Инкубация клеток, полученных из органоидов, для формирования монослоев.
- Использование анализа трансэпителиального электрического сопротивления и тестов на проницаемость для оценки функциональности барьера.
- Применение иммуноцитохимического анализа для характеристики клеток.
Основные результаты
- Успешное формирование функциональных эпителиальных барьеров в 2D-монослоях.
- Определение оптимизированных условий культивирования для кишечных клеток крупного рогатого скота.
- Подтверждение наличия микроворсинок и клеточных границ с помощью сканирующей электронной микроскопии.
- Иммунофлуоресцентное окрашивание выявило ключевые клеточные структуры в монослоях.
Выводы
- Разработанная система 2D-монослойной культуры является значительным достижением в изучении физиологии кишечника крупного рогатого скота.
- Данная модель имеет потенциал для применения в биомедицинских и трансляционных исследованиях.
- Она восполняет критический пробел в исследованиях, направленных на понимание здоровья и заболеваний кишечника крупного рогатого скота.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Создание надежных интерфейсов из 2D-монослоев на основе кишечных органоидов быка восполняет критический пробел в трансляционных моделях для изучения взаимодействия хозяина и патогена. Данное достижение позволяет проводить прогностический, видоспецифический анализ функции кишечного барьера, что способствует раннему обнаружению и механистическому снижению рисков в рамках разработки решений как для здоровья животных, так и для безопасности пищевых продуктов. Этот подход повышает уверенность в портфеле разработок, обеспечивая физиологически релевантные, воспроизводимые системы in vitro для моделирования заболеваний и оценки эффективности вмешательств.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишеней
- Позволяет проводить функциональную валидацию целостности эпителиального барьера с помощью количественного определения трансэпителиального сопротивления и анализов проницаемости.
- Обеспечивает механистическую оценку рисков путем моделирования взаимодействий между хозяином и патогеном в специфических для заболевания нишах кишечника крупного рогатого скота.
- Способствует основанному на гипотезах изучению вклада клеточных линий в функцию барьера.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированную, воспроизводимую платформу для количественной оценки влияния соединений на целостность эпителия.
- Обеспечивает доступ к просветам поверхностей для исследований прямого воздействия и высокопроизводительного скрининга.
- Позволяет проводить иммуноцитохимическую характеристику для подтверждения достоверности и воспроизводимости системы анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет результаты in vitro с физиологией крупного рогатого скота in vivo для разработки трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации в исследованиях безопасности пищевых продуктов и здоровья животных.
- Снижает трансляционный риск за счет моделирования как нормального, так и патологического состояния кишечника в контексте соответствующего вида.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Эта система 2D-монослоя интегрирована в континуум от этапа открытия до доклинических исследований, связывая ранние механистические исследования и трансляционную валидацию в области изучения желудочно-кишечного тракта крупного рогатого скота.
- Фундаментальная биология: позволяет проверять гипотезы о функционировании барьера и механизмах взаимодействия хозяина и патогена в контролируемой количественной системе.
- Скрининг: обеспечивает получение воспроизводимых монослоев, готовых к анализу, для оценки соединений и механистического скрининга.
- Аналитика: предоставляет количественные данные, такие как трансэпителиальное сопротивление и проницаемость, для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: способствуют согласованию результатов in vitro с моделями заболеваний in vivo и стратегиями поиска биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: создает многоразовую масштабируемую платформу для текущих исследований и разработок в области здоровья кишечника крупного рогатого скота и изучения патогенов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования и снижает механистическую неопределенность в исследованиях желудочно-кишечного тракта.
- Операционная ценность: Стандартизирует протоколы для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости между исследовательскими группами.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет раннего снижения рисков.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение программ по охране здоровья животных и безопасности пищевых продуктов.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами органоидов, биологией эпителия и количественными тестами на барьерную функцию.
- Необходим доступ к инфраструктуре для культивирования клеток, микропланшетным ридерам и возможностям иммуноцитохимического анализа.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости протокола и сопоставимости данных.
- Может потребоваться адаптация для различных отделов кишечника или моделей патогенов.
- Ограничения включают видоспецифичность и необходимость постоянной валидации по сравнению с показателями in vivo.
