Количественный анализ пищевых метаболитов витамина А в глазных и неглазных тканях мышей с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии
27 декабря 2024 г.
В данной работе описан метод нормальной фазы высокоэффективной жидкостной хроматографии для обнаружения и количественного определения критических ретиноидов, участвующих в облегчении зрительной функции как в глазной, так и в системной ткани, в контексте системного поступления витамина А для получения эссенциального светочувствительного родопсинового хромофора 11-цис-ретиналь.
Наша лаборатория исследует два важнейших транспортера витамина А, STRA6 и Rbpr2. Эти мембранные белки способствуют поступлению витамина А из крови в такие ткани, как глаза и печень. С помощью ВЭЖХ мы можем исследовать физиологические функции этих транспортеров, создавая системный профиль витамина А у трансгенных мышей.
Другой метод, используемый в нашей области, - это поверхностный плазмонный резонанс, SPR, который исследует аффинность и кинетику связывания белка по его вкусу, и мы применили SPR для исследования связывания между STRA6 или Rbpr2, комплексом связывания ретинола RBP4. Одной из текущих проблем этого метода является пропускная способность выборки. Этап испарения растворителя является основным узким местом в этом протоколе, и будущие исследователи должны экспериментировать с методами сушки, такими как испарение с продувкой азотом, которые имеют гораздо большую пропускную способность по сравнению с вакуумным испарением.
Мы определили роль Rbpr2 как важного фактора, способствующего поддержанию системного гомеостаза витамина А через его функцию в печени. Нарушение экспрессии Rbpr2 у трансгенных мышей привело к значительному нарушению уровня витамина А во всех исследуемых системных тканях, что количественно определено с помощью ВЭЖХ. Большинство других протоколов определения витамина А на основе ВЭЖХ используют методы обратной поверхности и, как правило, не позволяют изомерам ретиноидов растворяться отдельно.
Наш протокол нормального распознавания лица позволяет разрешать как ретиналдегид, так и изомеры сетчатки, что позволяет нам создать подробный профиль витамина А, что имеет решающее значение, учитывая важность фотоизомеризации витамина А в каскаде фототрансдукции.
Обзор
В данном исследовании изучается роль транспортеров витамина А STRA6 и RBPR2 в поглощении витамина А тканями глаза и системными тканями. С помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) изучаются физиологические функции этих транспортеров у трансгенных мышей.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биохимия
- Клеточная биология
Обзор
- Витамин A имеет решающее значение для зрительной функции.
- Транспортеры STRA6 и RBPR2 способствуют поглощению витамина A.
- ВЭЖХ используется для анализа профиля витамина A в тканях.
- Поверхностный плазмонный резонанс (SPR) позволяет оценить взаимодействия белков с лигандами.
Цель исследования
- Количественное определение ретиноидов, участвующих в зрительной функции.
- Изучение системного снабжения витамином А.
- Исследование аффинности связывания транспортеров витамина А.
Используемые методы
- Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).
- Поверхностный плазмонный резонанс (ППР).
- Трансгенные модели мышей для системного профилирования витамина А.
- Анализ кинетики связывания между транспортерами и ретинол-связывающими белками.
Основные результаты
- Успешный количественный анализ критически важных ретиноидов.
- Представление о физиологической роли STRA6 и RBPR2.
- Охарактеризованы аффинности связывания транспортеров с ретинолсвязывающими белками.
- Выявлены проблемы с пропускной способностью образцов при использовании SPR.
Выводы
- Данное исследование расширяет понимание механизмов транспорта витамина A.
- Полученные результаты могут быть использованы в будущих исследованиях зрительной функции.
- Методологические усовершенствования могут способствовать увеличению пропускной способности в исследованиях белков.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Количественное профилирование метаболитов витамина A в тканях мышей с помощью ВЭЖХ позволяет точно оценить системное и окулярное снабжение витамином A, что непосредственно дает информацию для валидации мишеней в зрительных путях, опосредованных GPCR. Эта аналитическая возможность способствует снижению механистических рисков на этапе поиска, особенно в отношении биологии транспортеров и метаболического потока в доклинических моделях. Надежное количественное определение метаболитов обеспечивает прогностическую достоверность трансляционных исследований нарушений зрения и обмена веществ.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать функцию транспортеров витамина A и поток по соответствующим путям in vivo.
- Способствует снижению биологических рисков путем количественного определения распределения метаболитов по тканям.
- Облегчает функциональную валидацию мишеней STRA6 и RBPR2 в доклинических моделях.
- Предоставляет количественные данные для повышения прогностической уверенности в программах, нацеленных на транспортеры.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает валидированные количественные показатели изомеров ретиноидов в сложных тканевых матрицах.
- Стандартизирует определение метаболитов для обеспечения воспроизводимости между экспериментальными сериями.
- Обеспечивает масштабируемость анализа и повторное использование платформы для исследований транспортеров и метаболизма.
- Позволяет проводить надежную оценку влияния химических соединений или генетических модификаций на метаболизм витамина A.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет профилирование метаболитов с релевантными моделями зрительного и системного дефицита витамина A.
- Обеспечивает непрерывный переход от этапа поиска к доклинической валидации функции транспортера.
- Обосновывает решения о продвижении терапевтических средств, нацеленных на транспортеры, с учетом оценки рисков.
- Предоставляет понимание механизмов системного гомеостаза и тканеспецифической доставки витамина A.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод на основе ВЭЖХ охватывает весь путь от начального этапа поиска до доклинических исследований, обеспечивая идентификацию ведущих соединений и изучение механизмов работы транспортеров витамина А.
- Биология открытий: Количественное профилирование метаболитов позволяет прояснить функцию транспортеров и выявить узкие места в метаболических путях.
- Скрининг: Воспроизводимость анализа и количественные результаты обеспечивают надежное сравнение генетических или фармакологических вмешательств.
- Аналитика: Хроматографические данные высокого разрешения позволяют проводить статистический анализ уровней метаболитов в различных тканях и условиях.
- Трансляционные исследования: Метод согласуется с доклиническими моделями системного и окулярного гомеостаза витамина A.
- Корпоративное повторное использование: Протокол может быть адаптирован для различных исследований профилей транспортеров, метаболизма и тканей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую уверенность и снижает механистическую неоднозначность в биологии транспортеров.
- Операционная ценность: стандартизирует количественное определение метаболитов и улучшает воспроизводимость исследований.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и снижает биологические риски на поздних этапах в программах, нацеленных на транспортеры.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение активов на стадиях поиска и доклинических исследований.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с ВЭЖХ и анализа хроматографических данных.
- Необходим доступ к высококачественному оборудованию и валидированным аналитическим стандартам.
- Для обеспечения воспроизводимости и сопоставимости данных необходима стандартизация между исследовательскими группами.
- Протокол применим к различным тканям мышей, однако может потребовать оптимизации для других видов или матриц.
- Пропускная способность при обработке образцов может быть ограничена этапами испарения растворителя, что указывает на необходимость оптимизации рабочего процесса.
