CIRCLE-Seq для исследования нецелевого редактирования генов
1 ноября 2024 г.
Существенным препятствием для таких технологий, как CRISPR, являются нецелевые события, которые могут нарушить работу жизненно важных генов. «Циркуляризация для сообщения in vitro об эффектах расщепления методом секвенирования» (CIRCLE-seq) — это метод, предназначенный для выявления непреднамеренных участков расщепления. Этот метод картирует полногеномную активность CRISPR-Cas9 с высокой чувствительностью и без смещения.
Наша команда занимается разработкой методов лечения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, iPSC, для тяжелых, в настоящее время неизлечимых кожных заболеваний, таких как рецессивный дистрофический буллезный эпидермолиз. Мы стремимся определить, может ли точное редактирование генов в сочетании с дифференцировкой iPSC в клетки кожи обеспечить жизнеспособный вариант лечения этих состояний. Редактирование генов в соматических клетках и ИПСК с использованием технологии CRISPR-Cas9 преобразует регенеративную медицину, позволяя создавать персонализированные методы лечения различных заболеваний, включая генетические нарушения кожи.
Современные проблемы генной инженерии включают в себя нецелевые эффекты редакторов генов. Для лечения требуются редакторы генов, которые точно корректируют интересующий ген, не изменяя никаких других мест в геноме. Наша задача состоит в том, чтобы продемонстрировать, что редакторы генов не вносят непреднамеренные изменения за пределы целевого гена.
Протокол CIRCLE-seq позволяет идентифицировать реальные потенциальные нецелевые сайты, которые другие подобные методы могли бы пропустить. Всесторонний анализ этих нецелевых сайтов дает ценную информацию о деятельности редакторов генома, повышая безопасность генной терапии, включая нашу терапию кожных заболеваний на основе IPSC. После выращивания индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в течение пяти дней соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте их в 10 миллилитрах PBS.
Смешайте шесть микролитров клеточной суспензии с шестью микролитрами трипанового синего для подсчета клеток. После подсчета аликвоту два умножить на 10 в степени семи ячеек на трубку. Центрифугируйте клетки при 300 G в течение трех минут при 25 градусах Цельсия и выбросьте надосадочную жидкость.
Подготовьте сфокусированный ультразвуковой аппарат путем самонаведения управляющего рычага. Наполните резервуар очищенной, деионизированной водой. На ноутбуке станции управления получите доступ к водопроводным сооружениям и нажмите «Заполнить», чтобы начать заполнение системы.
Отрегулируйте температуру до 4,5 градусов по Цельсию. Перенесите 25 микрограммов геномной ДНК, выделенной из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, в микротрубку. Заполните тюбик до общего объема 130 микролитров TE-буфером.
Установите условия для сдвига ДНК до средней длины 300 пар оснований, продолжительности 10 секунд, пиковой мощности 70, коэффициента заполнения 20 и циклов разрыва до 50. Разделите срезанную геномную ДНК на две части по 65 микролитров каждая. Очистите образцы, используя в 1,8 раза больше объема шариков XP, с последующей сепарацией магнитной решетки.
Перенесите надосадочную жидкость на новую ПЦР-планшет и измерьте количество ДНК с помощью спектрофотометра. Наконец, запустите один микролитр упомянутой геномной ДНК сдвига на магнитную станцию. Для начала ресуспендируйте oSQT1288 и адаптер шпильки до конечной концентрации 100 микромоляров в TE-буфере.
Для отжига адаптером смешайте 40 микролитров oSQT1288, 10 микролитров 10X STE и 50 микролитров воды, не содержащей нуклеаз, чтобы получить общий объем 100 микролитров. После отжига адаптера смешайте 10 микролитров буфера для лигирования 5X, пять микролитров ДНК-лигазы и пять микролитров отожженного адаптера для шпильки, Пипетка смешайте 20 микролитров мастер-смеси лигирования адаптера в каждый элюированный образец ДНК, содержащий гранулы. Поместите образцы в амплификатор при температуре 20 градусов Цельсия на один час, затем подержите при температуре четыре градуса Цельсия на неопределенный срок.
Затем перенесите 50 микролитров раствора спрея PEG/NaCl на ДНК, лигированную адаптером. Очистите образцы с помощью шариков XP и магнитной сепарации. Разбавьте образцы 30 микролитрами TE-буфера pH eight и сцедите надосадочную жидкость в новую полузакрытую ПЦР-планшет.
Объедините образцы и количественно оцените ДНК с помощью анализа dsDNA BR. Для приготовления мастер-смеси циркуляризации соедините восемь микролитров воды, не содержащей нуклеаз, 10 микролитров 10X TD4 ДНК-лигазы и два микролитра T4 ДНК-лигазы для получения общего объема 20 микролитров. Пипетка 20 микролитров циркулярной мастер-смеси на 80 микролитров 500 нанограмм ДНК, обработанной пользователем PNK.
Инкубируйте образец в амплификаторе при температуре 16 градусов Цельсия в течение 16 часов. На следующий день добавьте 100 микролитров шариков XP в циркуляризованную ДНК и очистите образцы, как было показано ранее. Разбавьте образец 38 микролитрами TE-буфера и сцедите надосадочную жидкость в новую ПЦР-планшет с полуюбкой.
Чтобы расщепить очищенную циркуляризованную геномную ДНК, приготовьте мастер-смесь для расщепления in vitro, соединив пять микролитров 10-кратного буфера Cas9, 4,5 микролитра Streptococcus pyogenes Cas9 и 1,5 микролитра геномной РНК общим объемом 11 микролитров. Инкубируйте мастер-смесь для расщепления при комнатной температуре в течение 10 минут. для формирования комплексов РНК Cas9 гРНК.
Разбавьте 125 нанограммов безопасной для плазмид геномной ДНКазы, обработанной ДНКазой, до конечного объема 39 микролитров в воде, не содержащей нуклеаз. Затем добавьте 11 микролитров мастер-смеси для расщепления к 39 микролитрам ДНК в общем объеме 50 микролитров. Инкубируйте смесь в термоамплификаторе в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия и поддерживайте ее на уровне четырех градусов Цельсия в течение неопределенного времени.
После инкубации добавьте 50 микролитров шариков XP в расщепленную in vitro ДНК и очистите ДНК на магнитной стойке. Разбавьте очищенную ДНК в 42 микролитрах TE буфера. Для анализа данных секвенирования нового поколения установите Python версии 2.7, Burrows-Wheeler Aligner и SAMtools.
Загрузите референсный геном с данного сайта. Определите файл FASTA референсного генома, выходной каталог для анализа и пути к командам BWA и SAMtools. Укажите целевые последовательности и пути к демультиплексированным файлам FASTQ как для нуклеазно-расщепленных, так и для контрольных образцов.
Выполните стандартный анализ на основе ссылок с помощью следующей команды. При выполнении полного конвейера найдите выходные результаты каждого шага в отдельной выходной папке, предназначенной для этого конкретного шага.
Обзор
В данной статье рассматривается метод CIRCLE-seq, который позволяет выявить сайты внецелевого расщепления при редактировании генов с помощью системы CRISPR-Cas9. Этот метод повышает безопасность генной терапии за счет картирования непреднамеренных событий расщепления с высокой чувствительностью.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Редактирование генов
- Технология CRISPR-Cas9
- Регенеративная медицина
Теоретическая база
- Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) исследуются для лечения тяжелых заболеваний кожи.
- Внецелевые эффекты при редактировании генов создают значительные трудности.
- Метод CIRCLE-seq позволяет идентифицировать потенциальные сайты внецелевого воздействия.
- Понимание внецелевых эффектов имеет решающее значение для безопасности генной терапии.
Цель исследования
- Разработка методов терапии генетических заболеваний кожи на основе иПСК.
- Обеспечение точного редактирования генов без непреднамеренных изменений генома.
- Повышение безопасности терапии на основе системы CRISPR.
Используемые методы
- Выделение и подготовка геномной ДНК из иПСК.
- Применение протокола CIRCLE-seq для идентификации сайтов внецелевого связывания.
- Секвенирование следующего поколения для проведения комплексного анализа.
- Анализ данных с использованием биоинформатических инструментов, таких как Python и SAMtools.
Основные результаты
- Метод CIRCLE-seq эффективно выявляет события внецелевого расщепления.
- Всесторонний анализ позволяет оценить безопасность редактирования генома.
- Демонстрируется потенциал терапии на основе иПСК для лечения заболеваний кожи.
- Подчеркивается важность точного редактирования генов в регенеративной медицине.
Выводы
- CIRCLE-seq является ценным инструментом для повышения безопасности технологий CRISPR.
- Понимание нецелевых эффектов имеет важное значение для разработки эффективных методов генной терапии.
- Данное исследование способствует развитию персонализированной медицины посредством применения иПСК.
Часто задаваемые вопросы
Промышленная значимость
Метод CIRCLE-seq позволяет научно-исследовательским группам в области биофармацевтики тщательно исследовать внецелевые эффекты редактирования генов с помощью CRISPR-Cas9, что является критически важным этапом для развития генной терапии. Обеспечивая высокочувствительное общегеномное обнаружение непреднамеренных сайтов расщепления, CIRCLE-seq повышает прогностическую достоверность и способствует снижению механистических рисков на этапах раннего поиска и трансляционных исследований. Эта возможность имеет принципиальное значение для принятия решений по портфелю разработок в области регенеративной медицины и клеточной терапии.
Стратегические приложения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Обеспечивает комплексное картирование побочной активности CRISPR-Cas9 для функциональной валидации мишеней.
- Поддерживает снижение механистических рисков путем выявления непреднамеренных геномных изменений перед переходом к доклиническим исследованиям.
- Повышает прогностическую уверенность в специфичности редактирования генов, что позволяет принимать обоснованные решения о целесообразности дальнейшего проведения работ.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает валидированные субстраты геномной ДНК для последующей разработки анализов и рабочих процессов скрининга.
- Позволяет получать количественные, воспроизводимые данные о событиях расщепления для стандартизации анализа.
- Обеспечивает возможность масштабируемой высокопроизводительной оценки специфичности гидовой РНК по нескольким мишеням.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет профилирование нецелевого воздействия с релевантными для конкретных заболеваний моделями iPSC для обеспечения трансляционной преемственности.
- Поддерживает продвижение генно-отредактированных клеточных препаратов с учетом рисков путем подтверждения геномной целостности.
- Улучшает согласованность биомаркеров путем связывания профилей расщепления с функциональными результатами в доклинических моделях.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Метод CIRCLE-seq находится на стыке раннего поиска, идентификации ведущих кандидатов и доклинической валидации, что обеспечивает его бесшовную интеграцию в рабочие процессы редактирования генома.
- Поисковая биология: способствует проверке гипотез и уточнению путей за счет выявления нецелевых эффектов CRISPR-Cas9.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные результаты для оценки специфичности направляющей РНК и Cas9.
- Аналитика: позволяет получать данные о сайтах расщепления с высоким разрешением для надежного статистического сравнения условий редактирования.
- Трансляционные исследования: связывает этап поиска с доклинической валидацией путем подтверждения точности редактирования в системах, релевантных для конкретных заболеваний.
- Корпоративное использование: устанавливает стандартизированный масштабируемый рабочий процесс для постоянной оценки безопасности редактирования генов в рамках различных программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неоднозначность в проектах по редактированию генов.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизированный, воспроизводимый и масштабируемый анализ внецелевых эффектов для внедрения в работу различных исследовательских групп.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективно распределять капитал при развитии портфеля за счет снижения рисков, связанных со специфичностью редактирования.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию и продвижение кандидатов для генной и клеточной терапии с учетом скорректированных рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в подготовке геномной ДНК, секвенировании следующего поколения и биоинформатическом анализе.
- Необходим доступ к сфокусированному ультразвуку, платформам секвенирования Illumina и вычислительной инфраструктуре.
- Требуется межкомандная стандартизация процессов подготовки образцов и конвейеров анализа данных.
- Метод может быть адаптирован для различных типов клеток и мишеней редактирования генов путем оптимизации протокола.
- Надежность обнаружения нецелевых эффектов зависит от качества секвенирования и точности референсного генома.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:23
Cell Culture and DNA Shearing Protocol for Genomic DNA Preparation from Induced Pluripotent Stem Cells
3:28
CIRCLE-Seq Library Preparation for Genomic DNA Circularization and Purification
5:58
In Vitro Cleavage of Circularized Genomic DNA and CIRCLE-Seq Data Analysis
