Определение ресничной функции и мембранной проницаемости псевдостратифицированного эпителия дыхательных путей легких

Наше исследование направлено на измерение двух важнейших биофизических свойств псевдостратифицированного эпителия дыхательных путей, которые могут быть получены путем дифференцировки нормальных эпителиальных клеток бронхов человека в воздушной жидкости. Мы идентифицировали различные особенности различных респираторных вирусов с помощью псевдостратифицированного эпителия дыхательных путей. Например, респираторно-синцитиальное воспаление цитоскелета, вызванное вирусом, которое является неканоническим механизмом бронхиолита.

Мы также идентифицировали гиперплазию бокаловидных клеток, увеличивающую репликацию SARS-CoV-2 при хронической обструктивной болезни легких эпителия дыхательных путей. Мы сосредоточились на выяснении механизма респираторно-синцитиальной вирус-индуцированной модуляции цитоскелетной сигнализации для выявления новых терапевтических мишеней для борьбы с РСВ-инфекцией и вирус-индуцированным бронхиолитом. Для начала примите нормальную суспензию клеток бронхиального эпителия человека, или NHBE.

С помощью пипетки P200 добавьте 50 000 ресуспендированных клеток в 200 микролитрах полной эпителиальной клетки дыхательных путей, или AEC, среды на апикальную сторону вставки. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе для клеточных культур с влажностью углекислого газа от 85% до 95%. Как только клетки сольются, перенесите вкладыши в пустую лунку с помощью стерильных щипцов.

С помощью пипетки P1000 аспирируйте всю базальную AEC-среду. Затем добавьте в базальную лунку 500 микролитров свежей среды для полной дифференцировки ALI с добавлением 2% пенициллин-стрептомицина и 1% амфотерицина B. С помощью стерильных щипцов перенесите вставки в базальную лунку с добавлением полной среды ALI.

С помощью пипетки P200 аккуратно отасуньте апикальную среду AEC из лунки и инкубируйте ее. Через 48 часов перенесите вкладыши в пустую лунку с помощью стерильных щипцов. С помощью пипетки P1000 отсадите старую среду и добавьте 500 микролитров свежей полной среды ALI.

Поместите вкладыши обратно в лунку со свежей средой с помощью стерильных щипцов. На 26 день с помощью пипетки Р200 добавьте 100 микролитров DPBS на апикальную сторону вкладышей. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в увлажнённом инкубаторе для клеточных культур в течение 30 минут.

Затем аспирируйте DPBS с помощью пипетки P200. Для начала включите микроскоп, подключенный компьютер и камеру окружающей среды. Откройте дверцу камеры и поместите пластину со вставками с элементами NBHE на предметный столик микроскопа.

Как только тарелка окажется на сцене, закройте камеру. Затем с помощью ручки управления столиком микроскопа переместите пластину и поместите вставки в поле зрения. На экране компьютера нажмите на значок системы SAVA, чтобы открыть программу SAVA.

В интерфейсе программного обеспечения нажмите «Настроить эксперимент». В следующей вкладке нажмите «Создать эксперимент». Затем в новой вкладке введите директорию, в которой будут храниться данные, в поле «Введите имя директории эксперимента» и укажите подробности в поле «Введите описание эксперимента», затем нажмите «ОК». Теперь нажмите на созданный эксперимент, который отображается в каталоге в разделе «Эксперименты».

После этого нажмите «Изменить» и укажите сведения об образце в поле «Описание образца». Нажмите «Добавить», затем нажмите «Выйти», чтобы выйти из вкладки. В главном интерфейсе программы выберите созданный эксперимент из выпадающего меню в слоте Эксперимент.

Затем нажмите «Записать видео», чтобы отслеживать частоту биения ресничек на экране компьютера. На экране будет отображаться сфокусированное движение ресничек. Для каждой вставки запишите шесть различных случайных полей в течение 2,1 секунды со скоростью 120 кадров в секунду.

Нажмите «Сохранить видео», чтобы отслеживать данные о частоте биения ресничек. Чтобы проанализировать данные, нажмите «Анализировать видео» в интерфейсе программного обеспечения. И в следующей вкладке нажмите OK. Затем перейдите на следующую вкладку и нажмите «Проанализировать все».

Загрузите электронную таблицу, созданную для каждого эксперимента, в папку SAVA Data Acquisition на компьютере. Возьмем среднюю частоту Гаусса для представления данных. Частота биения ресничек достигала не менее трех герц как для эпителия дыхательных путей здоровых взрослых, так и для пациентов с ХОБЛ, демонстрируя сопоставимую функцию ресничек.

Для начала включите вольт-омметр EVOM2 с помощью выключателя питания. Подключите тестовый резистор к EVOM2 через входной слот. Следите за показаниями на экране EVOM2.

Если показания выше или ниже 1 000, поверните переключатель ADJ на EVOM2 с помощью щипцов до тех пор, пока он не покажет равномерное показание 1 000 для калибровки устройства. Теперь возьмем пустую вставку для показаний экспериментального контроля. С помощью пипетки P200 добавьте 100 микролитров DPBS на апикальную сторону пустого вкладыша.

Затем добавьте 500 микролитров DPBS на базальную сторону с помощью пипетки P1000. После этого отсоедините тестовый резистор и подключите электрод STX2 к входному слоту на EVOM2. Затем аккуратно очистите электрод STX2 70% этанолом.

Вставьте электрод STX2 в пустую вставку с помощью DPBS, держа более короткую ножку электрода на апикальной части, а длинную — на базальной. Теперь запишите стабильные показания на экране EVOM2. Далее с помощью пипетки P200 добавьте 100 микролитров DPBS на апикальную сторону вкладыша.

Вставьте электрод STX2 во вставку с 26-дневным дифференцированным эпителием дыхательных путей, как показано ранее. Затем запишите стабильные показания на экран EVOM2. Значения трансэпителиального электрического сопротивления увеличивались у взрослых с ХОБЛ, что указывает на повышенную непроницаемость мембраны при ХОБЛ.