Комплексный конвейер для оценки эффективности эритропоэза человека in vitro и ex vivo
10 января 2025 г.
Моделирование эритропоэза дает ценную возможность понять биологическое значение участников этого процесса и оценить новые терапевтические подходы, которые могут облегчить дефекты дифференцировки. В данной статье мы описываем простой и надежный метод эффективной дифференцировки CD34+ гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток ex vivo.
Наши исследования сосредоточены на лейкемии, в частности на миелодиспластических синдромах или миелодиспластической неоплазии. Это заболевание стволовых клеток, происходящее из гемопоэтических стволовых клеток. Он влияет на различные линии клеток крови, особенно на эритроидную линию, которая отвечает за выработку сердечных клеток крови.
Нарушение этой линии может привести к анемии, которая обычно наблюдается у пациентов с МДС. Конвейер, который мы представляем в этой статье, позволяет использовать надежный и упрощенный метод оценки эффективности эритробластов человека in vitro при модификации генов или медикаментозном лечении. Гемопоэтические стволовые клетки присутствуют с рождения и до последнего момента нашей жизни.
В нашем организме больше нет пролиферативной ткани с триллионами клеток, производимых каждый день. Еще так много вещей нужно понять, поэтому мы продолжим изучать эти удивительные клетки в здоровых аминотканях, уделяя особое внимание протеостазу и биологии РНК. Для начала разморозьте 100 000 клеток CD34+UCK, опустив флакон на 30 секунд на водяную баню, установленную при температуре 37 градусов Цельсия.
Добавьте один миллилитр размораживающей среды по каплям во флакон, затем осторожно восстановите клетки, пипетируя вверх и вниз. Переложите ресуспендированную клеточную суспензию по капле в пять миллилитров размораживающей среды. Затем центрифугировать клеточную суспензию в течение восьми минут при 320 G при комнатной температуре.
Промойте клетки в 10 миллилитрах флуоресцентно-активируемой сортировки клеток или буфере FACS с ДНКазой. После повторного центрифугирования клеток повторно суспендируйте гранулу в двух миллилитрах среды для стимуляции. Перелейте два миллилитра клеточной суспензии в 24-луночный планшет и инкубируйте планшет в течение четырех-шести часов при температуре 37 градусов Цельсия.
Затем соберите клетки в пробирки для сортировки клеток, активируемых флуоресценцией, и долейте в них один миллилитр среды для стволовых клеток. После размораживания вируса добавьте необходимый объем в стимулирующую среду для достижения кратности инфекции 30. Ресуспендировать гранулированные клетки в вируссодержащих средах с плотностью 100 000 клеток на 100 микролитров вируса и перенести их в одну лунку 96-луночного планшета.
Добавьте PBS в пустые лунки и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. Затем перенесите полный объем клеточной суспензии из лунки 96-луночного планшета в пробирки FACS с одним миллилитром среды стволовых клеток. Промойте лунку и наконечник пипетки средой для стволовых клеток, чтобы добавить два миллилитра среды стволовых клеток в пробирку FACS.
После центрифугирования трубки FACS выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в двух миллилитрах расширительной среды. Переложите суспензию в лунку на 24 лунки планшета и инкубируйте клетки. Для начала перенесите весь объем CD34+клеток, трансдуцированных с помощью репортера EGFP, в отдельную пробирку FACS.
Центрифугируйте при 320 G в течение восьми минут при комнатной температуре. Ресуспендируйте гранулированные элементы в 100 микролитрах буфера FACS. Добавьте пять микролитров антител к CD34 в пробирку и инкубируйте пробирки в темноте при температуре четыре градуса Цельсия в течение 20 минут.
Затем повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре буфера FACS, содержащем DAPI, и центрифугируйте в течение восьми минут при 320 G при комнатной температуре. После ресуспендирования клеток в 200 микролитрах буфера FACS, содержащего DAPI, перед сортировкой отфильтруйте клеточную суспензию через сетчатое фильтр с плотностью 40 микрометров. Далее добавьте 0,5 микролитра антитела CD34 на одну каплю гранул в 100 микролитров PBS.
Выдерживайте смесь в темноте при температуре четыре градуса Цельсия в течение 20 минут. Затем добавьте в смесь один миллилитр PBS. Центрифугируйте в течение восьми минут при 320 G при комнатной температуре.
Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах PBS. Затем добавьте GFP-отрицательные и GFP-положительные лейкозные клетки в пробирку FACS. Промойте ячейки в одном миллилитре буфера FACS.
После центрифугирования клеток ресуспендируют 100 000 GFP-отрицательных клеток и 100 000 GFP-положительных клеток, каждая в 500 микролитрах буфера FACS. Перед сортировкой отфильтруйте суспензию клеток через сетчатое фильтр 40 микрометров. Затем соберите отсортированные клетки в среду для стволовых клеток.
Центрифугируйте ячейки в течение восьми минут при 320 G при комнатной температуре. Затем ресуспендируйте клетки в трех миллилитрах эритроидной дифференцировочной среды. Теперь распределите один миллилитр ресуспендированных клеток в три лунки 24-луночного планшета.
Заполните все внешние лунки PBS. Чтобы освежить носитель, убедитесь, что ячейки осели в нижней части пластины. Аккуратно наклоните пластину и удалите 500 микролитров среды.
Затем добавьте 500 микролитров 2Х среды для дифференцировки цитокина эритроидов для освежения пластины. На шестой день перенесите клетки в 12-луночный планшет и добавьте по одному миллилитру среды в каждую лунку, чтобы достичь конечного объема в два миллилитра. Соберите по 200 микролитров клеток из каждой лунки 12-луночного планшета.
Замените удаленный объем 250 микролитрами 2X среды для дифференцировки эритроидов. Добавьте один миллилитр буфера FACS в каждую пробирку для сбора. После центрифугирования пробирок повторно суспендируйте гранулированные элементы в 100 микролитрах буфера FACS.
Добавьте по одному микролитру антител к CD71, CD34 и CD235a в пробирки. Затем ресуспендируйте клетки в одном миллилитре буфера FACS, содержащего DAPI. Центрифугируйте пробирки в течение восьми минут при 320 G при комнатной температуре.
Ресуспендируйте клетки в 200 микролитрах буфера FACS с DAPI. Установите DAPI в зависимости от бокового рассеивания или SSC, чтобы исключить мертвые ячейки. Установите высоту SSC относительно площади SSC, чтобы исключить агрегаты и выбрать отдельные ячейки.
Установите область рассеяния вперед относительно SSCA, чтобы удалить мусор в зависимости от размера. Установите CD235a против CD71. Установите CD34 против SSCA.
Прогоните бусины GFP-положительными клетками и DAPI-окрашенными клетками. Компенсируйте показания и примените компенсацию к настройкам цитометра. CD34-положительные клетки из пуповинной крови показали увеличение количества аннексин V положительных апоптотических клеток с 14,4% на четвертый день до 34,2% на 17-й день.
Гистограмма показывает значительное увеличение процента Аннексин V-положительных клеток к 17-му дню, достигая примерно 40%
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании изучается дифференцировка гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников CD34+ ex vivo, при этом рассматриваются критические процессы, участвующие в эритропоэзе, и их значение для лечения связанных с этим заболеваний, таких как миелодиспластические синдромы. Предоставляя упрощенный метод оценки эффективности эритробластов, данная работа направлена на углубление понимания нарушений, приводящих к развитию анемии у таких пациентов.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Эритропоэз
- Миелодиспластические синдромы
- Биология гемопоэтических стволовых клеток
Теоретическая часть
- Миелодиспластические синдромы представляют собой заболевания стволовых клеток, поражающие линии кроветворения.
- Нарушение эритроидного ростка может привести к анемии.
- Понимание механизмов функционирования гемопоэтических стволовых клеток имеет решающее значение, так как они сохраняются на протяжении всей жизни человека.
Используемые методы
- Размораживание и ресуспендирование CD34+ клеток ПВК
- Трансдукция клеток с внесением генетических модификаций
- Сортировка клеток с помощью флуоресцентно-активированного клеточного сортера (FACS)
Основные результаты
- В клетках CD34+ наблюдалось увеличение показателей апоптоза с течением времени.
- Была продемонстрирована эффективная дифференцировка в эритробласты.
- Разработанные специфические методы позволяют проводить оценку после генетической модификации или лекарственной терапии.
Выводы
- В исследовании представлен надежный метод дифференцировки гемопоэтических клеток, который может привести к созданию более эффективных методов лечения анемии, вызванной миелодиспластическими синдромами.
- Данная работа подчеркивает важность понимания процессов клеточной дифференцировки в биологии стволовых клеток.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Эффективная оценка эритропоэза человека имеет решающее значение для снижения рисков на ранних этапах разработки гематологических препаратов, а также для понимания механизмов развития анемии и миелодиспластических синдромов. Данный рабочий процесс обеспечивает надежную количественную оценку эритроидной дифференцировки и функции генов как в здоровых системах человека, так и в системах, моделирующих соответствующие заболевания. Этот подход позволяет с высокой степенью уверенности проводить валидацию мишеней и принимать обоснованные решения по портфелю методов терапии, модулирующих эритропоэз.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать функцию генов и влияние сигнальных путей на коммитирование эритроидной линии.
- Способствует снижению биологических рисков путем количественной оценки эффектов генетических воздействий или воздействия соединений на эритропоэз.
- Облегчает функциональную валидацию мишеней в первичных гемопоэтических стволовых клетках и клетках-предшественниках человека.
- Обеспечивает понимание механизмов патологических нарушений, характерных, например, для миелодиспластических синдромов.
Скрининг и разработка анализа
- Создает валидированные системы in vitro и ex vivo для скрининга соединений, влияющих на эритроидную дифференцировку.
- Обеспечивает воспроизводимые количественные показатели с помощью проточной цитометрии и идентификации клеток по маркерам.
- Поддерживает стандартизацию анализа для сопоставимости результатов между различными исследованиями и группами.
- Подготавливает масштабируемые платформы для оценки модуляции генов и стратегий лекарственного восстановления.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет результаты исследований in vitro с моделями ex vivo, полученными от пациентов, для обеспечения трансляционной преемственности.
- Позволяет осуществлять риск-ориентированное продвижение кандидатов с доказанным воздействием на эритропоэз.
- Способствует разработке биомаркеров путем отслеживания маркеров дифференцировки и апоптоза в разные временные точки.
- Обеспечивает механизм снижения рисков при выборе доклинических кандидатов в портфелях гематологических исследований.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод объединяет этапы от начального поиска до идентификации ведущих соединений и доклинической валидации в рамках разработок, ориентированных на гематологию.
- Открывающая биология: Количественная оценка влияния генов и соединений на спецификацию и созревание эритроидной линии.
- Скрининг: Предоставление стандартизированных, воспроизводимых методов анализа на основе проточной цитометрии для скрининга соединений и генетических модификаций.
- Аналитика: Предоставление количественных данных, таких как уровень апоптоза и экспрессия маркеров, для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: Связь результатов in vitro и ex vivo с моделями заболеваний, имеющими клиническое значение для пациентов.
- Корпоративное повторное использование: Предоставление модульного, многократного рабочего процесса, адаптируемого к различным генным мишеням и библиотекам соединений.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую уверенность при валидации мишеней и понимании механизмов эритропоэза.
- Операционная ценность: стандартизирует рабочие процессы для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости в группах НИОКР.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать обоснованные решения о целесообразности дальнейшей разработки («go/no-go») и снижает биологические риски на поздних этапах программ в области гематологии.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию мишеней и соединений с подтвержденными эритроидными эффектами с учетом оценки рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами гемопоэтических стволовых клеток и анализ методом проточной цитометрии.
- Необходим доступ к оборудованию для FACS и валидированным панелям антител к эритроидным маркерам.
- Требуется межгрупповая стандартизация стратегий гейтинга и интерпретации данных.
- Метод может быть адаптирован как для образцов здоровых доноров, так и для образцов, полученных от пациентов, для расширения области применения.
- Воспроизводимость результатов зависит от надежного источника клеток и контроля качества.
