U-образная техника горизонтального плавания для получения высококачественной спермы с низким индексом фрагментации ДНК

[Рассказчик] Исследование сосредоточено на методе оптимизации сперматозоидов, направленном на определение того, дает ли метод UHS преимущества в получении спермы высокого качества с низким индексом фрагментации ДНК. Микрофлюидная технология была использована для оптимизации отбора сперматозоидов высокого качества с более низким DFI. Основным ограничением метода UHS является его высокая зависимость от способности к самостоятельному плаванию спермы высокого качества. Метод UHS не подходит для пациентов с полностью неподвижными сперматозоидами. Тигмотаксис играет решающую роль в разделении сперматозоидов. U-образная орбита имеет более длинную границу, что способствует свободному перемещению сперматозоидов высокого качества, позволяя полностью отделить их от неподвижных сперматозоидов, примесей и других компонентов. По сравнению с методом DGC, метод UHS lane предполагает меньшее количество ручных операций для персонала лаборатории, а высококачественная сперма, полученная с помощью метода UHS lane, не подвергается повторным процедурам центрифугирования, что приводит к более низкому DFI. Для начала добавьте в рабочую тарелку 20 микролитров среды для удобрения для создания-образных дорожек. Отсосите пипеткой 10 микролитров удобряющей среды до создания круговой капли в левой начальной точке-образной дорожки. Используя удобряющую среду, создайте две буферные капли по 10 микролитров каждая с интервалами вдоль левого среднего участка U-образной дорожки. Соедините все капли с удобряющей средой, чтобы образовалась непрерывная дорожка. Используйте 2,5 микролитра поливинилпирролидона, или PVP, чтобы создать длинную полосу капли жидкости с правой стороны U-образной дорожки. Сделайте шесть микрокапель с помощью среды для обработки ооцитов с правой стороны полоски ПВП. Добавьте в блюдо семь миллилитров питательного масла, следя за тем, чтобы масло полностью покрывало самую высокую точку капель. Поместите чашку в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия, 6% углекислым газом на ночь, чтобы сбалансироваться. После сбора спермы измерьте ее объем с помощью метода взвешивания, обеспечив точность до 0,01 миллилитров. Поместите образец спермы в среду с температурой 37 градусов Цельсия на 15–30 минут и аспирируйте его в пластиковую одноразовую пипетку с широким отверстием. Если сперма не разжижается в течение 60 минут, добавьте равное количество оплодотворяющей среды. Многократно вдыхайте и выдыхайте смесь с помощью одноразовой пластиковой пипетки для переноса до полного разжижения. Измерьте значение pH спермы с помощью прецизионной бумаги для измерения pH в диапазоне от шести до 10. Возьмите 10 микролитров полностью разжиженной спермы и капните ее в макулярную счетную камеру. Оцените подвижность сперматозоидов в 200-кратном поле с помощью оптического микроскопа. Добавьте пять микролитров спермы в микрокаплю среды для удобрения в левую начальную точку П-образной дорожки в операционной чашке ИКСИ. Отрегулируйте угол и положение иглы, удерживающей ооцит, и инъекционной иглы под объективом 4X. После проверки настройки перенесите выбранный ооцит в микрокаплю среды обработки ооцитов в операционной чашке ИКСИ. Поместите операционную чашку с ооцитами на горячую сцену подготовленного оператора микроскопа. После регулировки фокуса опустите инъекционную иглу в полоску ПВП операционной чашки ИКСИ. Переместите иглу для инъекций в длинную полоску с правой стороны U-образной дорожки и извлеките сперматозоиды высокого качества. Перенесите сперму в полоску PVP с правой стороны и поместите сперму на дно операционной чашки. Аккуратно надавите иглой для инъекции в среднюю или нижнюю часть хвоста сперматозоида. Быстро оттяните иглу для инъекций назад и поцарапайте сперму, чтобы обездвижить ее. Теперь вдохните сперму от хвоста к головке в иглу для инъекций. Медленно вводите сперматозоиды в цитоплазму ооцита, и инкубируйте введенный ооцит. Добавьте 1,5 миллилитров раствора для центрифугирования с градиентом плотности 45% в стерильную коническую пробирку с коническим дном объемом 15 миллилитров. И медленно добавьте 1,5 миллилитра градиентного раствора центрифугирования 90% плотности на дно 45% градиентного раствора. Теперь добавьте разжиженную сперму в раствор градиентного центрифугирования и вращайте пробирку при 300 G в течение 15 минут при комнатной температуре. После удаления надосадочной жидкости соберите примерно 0,5 миллилитра оставшегося осадка сперматозоидов и смешайте его с тремя миллилитрами оплодотворяющей среды. Центрифугируйте смесь при 200 G в течение пяти минут при комнатной температуре. Осторожно выведите надосадочную жидкость пипеткой, оставив примерно 0,2 миллилитра осадка, затем встряхните и перемешайте, чтобы снова взвесить осадок. Наконец, подсчитайте концентрацию и подвижность сперматозоидов перед хранением образца в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия, 6% углекислого газа для последующего использования. Поместите пробирку, содержащую 25 микролитров раствора агарозы с низкой температурой плавления, в водяную баню с температурой от 90 до 100 градусов Цельсия на одну-две минуты. Затем переведите трубку на водяную баню с температурой 37 градусов Цельсия на пять минут, пока температура не стабилизируется. Добавьте от трех до 10 микролитров спермы в агарозные пробирки с низкой температурой плавления и тщательно перемешайте. Капните 30 микролитров смеси на предварительно обработанное предметное стекло в горизонтальном положении. После накрытия поместите предварительно обработанное стекло в холодильник при температуре от двух до восьми градусов Цельсия на четыре минуты, следя за тем, чтобы оно оставалось в горизонтальном положении. Достаньте предметную горку из холодильника и аккуратно сдвиньте с покровного стекла. Быстро погрузите предварительно обработанное предметное стекло в денатурирующий раствор на семь минут. Снимите предметное стекло и поставьте его в вертикальное положение. Затем используйте фильтровальную бумагу, чтобы впитать лишние капли воды, не касаясь области образца. Промойте предметное стекло в дистиллированной воде в течение пяти секунд. Погружайте предметное стекло серийно в подходящие растворы для конкретного периода. Затем, держа предварительно обработанное стеклянное стекло в горизонтальном положении, добавьте на предметное стекло около одного миллилитра смешанного раствора красителя. После окрашивания в течение пяти минут аккуратно промойте витражное стекло дистиллированной водой от 10 до 15 раз. Высококачественные сперматозоиды с хорошей прогрессивной подвижностью плавно плавно проплывают по краю U-образной дорожки, облегчая интрацитоплазматической иглой для инъекции сперматозоидов по отдельности. Несмотря на то, что с помощью обоих методов были получены хорошие сперматозоиды, индекс фрагментации ДНК сперматозоидов высокого качества, отделенных методом центрифугирования с градиентом плотности, был значительно выше по сравнению с U-образным методом горизонтального плавания.