Визуализация in vivo переходных процессов кальция во время оплодотворения и раннего развития у C. elegans
12 июля 2024 г.
Здесь мы представляем протоколы и инструменты для визуализации кальция во время оплодотворения и раннего эмбриогенеза с использованием генетически кодируемого кальциевого репортера, экспрессируемого в зародышевой линии модельной нематоды C. elegans.
Производство жизнеспособных эмбрионов – сложный процесс. Наша общая цель состоит в том, чтобы определить клеточные сигналы, которые координируют переход от ооцита к эмбриону. CaFE reporter — это новый инструмент, разработанный для визуализации сигналов кальция, которые возникают при оплодотворении и во время раннего эмбриогенеза.
Используя репортер CaFE, мы обнаружили задержку кальциевой волны в ооцитах с преждевременной овуляцией. Мы также обнаружили присутствие одноклеточных кальциевых транзиентов во время раннего эмбриогенеза. Оба результата иллюстрируют полезность генетически закодированного индикатора кальция на ранних стадиях развития.
Предыдущие методы визуализации кальциевых ооцитов основывались на введении красителя в половую железу. Эта методика трудоемка и требует специализированного оборудования для микровпрыска. Репортер CaFE позволяет легко визуализировать зубец кальция в ооцитах и эмбрионах с помощью широко доступного оборудования.
CaFE Reporter облегчает исследование сроков и регуляции передачи сигналов кальция в ооцитах и эмбрионах. Этот репортер можно легко объединить с существующими мутантами, маркерами и нокдаунами РНК-интерференции, чтобы раскрыть поведение кальция относительно других знаковых событий на ранних этапах эмбриогенеза, таких как созревание миотиков. Для начала возьмитесь за ручку червячной кирки и ослабьте серебряный воротник по направлению к его голове, чтобы четыре секции разошлись.
Поместите 1,5-дюймовую платиновую проволоку в середину четырех секций. Удерживайте проволоку в центре, затягивая хомут, чтобы соединить четыре секции. Используя плоскогубцы с плоским носиком, тщательно придайте форму проволоке и многократно зажмите конец проволоки, чтобы создать около двух-трех миллиметровых ножек.
Используйте эту ногу, чтобы подцепить червей. Приготовьте раствор 3%-ной агарозы в воде и нагрейте его в микроволновой печи до полного растворения агарозы. Поместите пустое предметное стекло микроскопа между двумя другими предметными стеклами микроскопа, которые имеют один слой лабораторной ленты по длинной оси.
С помощью пипетки объемом в один миллилитр капните нагретый 3%-ный раствор агарозы на центр пустого предметного стекла. Быстро поместите новое предметное стекло микроскопа на агарозную каплю перпендикулярно пустому предметному стеклу так, чтобы капля лежала на соседних скотчанных предметных стеклах, затем аккуратно разделите предметные стекла, сохраняя подушечку нетронутой. С помощью пипетки объемом 20 микролитров добавьте в центр агарозной подушечки небольшую каплю одномиллимолярного левамизола в буфере М9, чтобы парализовать червей.
Выберите не менее пяти синхронизированных червей и осторожно прикоснитесь ножкой ручки червячного кирки к капле левамизола, чтобы перенести червей. Аккуратно накройте агарозную подушечку покровным листом. Проверьте расположение червей, так как соскальзывание крышки может привести к рассеиванию червей.
Пометьте предметное стекло микроскопа соответствующими деталями, такими как название штамма червя. Определите местонахождение червей с помощью маломощного объектива на микроскопе с использованием светлого освещения. Используйте как минимум 20-кратный воздушный объектив или 40-кратный иммерсионный объектив для четкой визуализации кальциевой волны в ооцитах.
Для оптимальной визуализации флуоресцентных репортеров отрегулируйте усиление или время экспозиции для каналов GFP и RFP. Исследуйте каждую яйцеклетку в рукавах гонад червя, чтобы определить, является ли событие оплодотворения неизбежным. После разрушения ядерной оболочки цитоскелет самого проксимального яйцеклетки минус один перестраивается, приобретает округлый вид и отделяется от яйцеклетки минус два.
Когда овуляция произойдет в ближайшее время, немедленно начните запись видео в широкоугольной камере. Проксимальный ооцит обозначается знаком минус один непосредственно перед сперматекой, где хранятся сперматозоиды. Самый последний эмбрион находится ближе всего к сперматетеке, но внутри матки.
Кальциевая волна демонстрирует двухфазную картину, начиная с быстрого всплеска, за которым следует волна флуоресценции, движущаяся от точки входа к противоположному полюсу. Кальциевый сигнал наблюдался сразу после входа в сперматеку в ведущем минус одном ооците, но не в замыкающем минус двух ооцитах. Эмбрионы внутриутробного и внутриутробного состояния проявляли флуоресцентный сигнал в одной клетке во время эмбриогенеза.
Обзор
В данном исследовании представлен репортер CaFE — генетически закодированный индикатор кальция, используемый для визуализации динамики кальция в процессе оплодотворения и раннего эмбриогенеза у C. elegans. Результаты демонстрируют задержанную волну кальция в преждевременно овулировавших ооцитах и одноклеточные кальциевые транзиенты в ходе раннего развития.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология развития
- Клеточная сигнализация
Введение
- Понимание механизмов кальциевой сигнализации имеет решающее значение для изучения оплодотворения и эмбриогенеза.
- Предыдущие методы визуализации кальция в ооцитах были трудоемкими и требовали специализированного оборудования.
- Репортер CaFE упрощает процесс визуализации.
- Кальциевая сигнализация играет ключевую роль в переходе ооцита в стадию эмбриона.
Цель исследования
- Определить клеточные сигналы, которые координируют оплодотворение и ранний эмбриогенез.
- Использовать репортер CaFE для облегчения визуализации динамики кальция.
- Изучить поведение кальция относительно других событий развития.
Используемые методы
- Разработка репортера CaFE для визуализации кальция.
- Использование агарозных подушек для иммобилизации C. elegans во время наблюдения.
- Методы микроскопии для визуализации кальциевых волн и транзиентов.
- Сочетание репортера с существующими мутантами и РНК-интерференцией (RNAi knockdown).
Основные результаты
- Идентификация замедленной кальциевой волны в преждевременно овулированных ооцитах.
- Наблюдение за транзиентами кальция в отдельных клетках в ходе раннего эмбриогенеза.
- Демонстрация полезности репортера CaFE в исследованиях развития.
- Визуализация двухфазного паттерна кальциевой волны при оплодотворении.
Выводы
- Репортер CaFE является эффективным инструментом для изучения кальциевой сигнализации у C. elegans.
- Он облегчает исследование роли кальция в раннем эмбриональном развитии.
- Данный подход может углубить понимание клеточной сигнализации в процессе оплодотворения.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Визуализация транзиентов кальция в режиме реального времени in vivo во время оплодотворения и раннего эмбриогенеза у C. elegans позволяет напрямую исследовать события клеточной сигнализации, имеющие решающее значение для переходов в развитии. Репортерная система CaFE предоставляет надежную и воспроизводимую платформу для анализа времени и регуляции кальциевой сигнализации, что повышает прогностическую достоверность на этапе раннего поиска и снижает механистические риски. Данная возможность усиливает валидацию мишеней и позволяет принимать обоснованные с учетом рисков решения по формированию портфеля исследований в области биологии развития и клеточной сигнализации.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Обеспечивает прямую визуализацию динамики кальциевой сигнализации в процессе перехода от ооцита к эмбриону.
- Способствует функциональной валидации генетических или фармакологических воздействий, влияющих на оплодотворение и эмбриогенез.
- Помогает снизить механистические риски за счет уточнения роли сигнальных путей в событиях развития.
- Предоставляет количественные данные для проверки гипотез о работе сигнальных путей.
Скрининг и разработка методов анализа
- Предоставляет стандартизированную систему генетически кодируемых репортеров для воспроизводимой визуализации кальция.
- Снижает технические сложности за счет устранения необходимости в инъекциях красителя и использовании специализированного оборудования для микроинъекций.
- Обеспечивает возможность масштабируемого скрининга мутантов или РНК-интерференционного нокдауна для изучения влияния на кальциевую сигнализацию.
- Поддерживает разработку количественных методов анализа с использованием надежных данных на основе флуоресценции.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям, имеющим отношение к заболеваниям, для изучения консервативных механизмов сигнализации в раннем развитии.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации мишеней сигнализации.
- Предоставляет прогностические данные о клеточных процессах, лежащих в основе нарушений развития.
- Способствует продвижению с учетом рисков мишеней, участвующих в кальций-зависимых путях.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Репортерная система CaFE интегрируется в континуум открытий — от ранних механистических исследований до валидации на доклинических моделях, обеспечивая как проверку гипотез, так и количественный скрининг.
- Открытия в биологии: позволяет в режиме реального времени проверять гипотезы о передаче сигналов кальция в процессе оплодотворения и эмбриогенеза.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные показатели флуоресценции для скрининга мутантов и РНК-интерференции.
- Аналитика: позволяет измерять время возникновения, амплитуду и пространственную динамику кальциевых волн для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: связывает фундаментальные сигнальные события с процессами развития, имеющими значение для патологии.
- Повторное использование в масштабах предприятия: представляет собой пригодную для повторного использования генетически кодируемую платформу, адаптируемую к различным генетическим фонам и экспериментальным условиям.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую уверенность и снижает механистическую неоднозначность в исследованиях сигнальных путей развития.
- Операционная ценность: Стандартизирует рабочие процессы визуализации кальция и повышает воспроизводимость результатов между исследовательскими группами.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет раннего уточнения релевантности мишени.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритезацию сигнальных мишеней для дальнейшей разработки с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с флуоресцентной микроскопией и генетическими манипуляциями с C. elegans.
- Необходим доступ к стандартной инфраструктуре визуализации и базовым инструментам молекулярной биологии.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов визуализации и анализа данных.
- Метод адаптируем к различным генетическим фонам и совместим с РНК-интерференцией и мутантными штаммами.
- Применимость ограничена прозрачными, доступными для изучения моделями организмов с разработанным генетическим инструментарием.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:20
Constructing a Worm Pick and Mounting the Worms for Imaging to Assess Fertilization and Embryogenesis in C. elegans
3:22
Confocal Imaging of Calcium During Fertilization in C. elegans to Study Oocyte-to-Embryo Transition
4:21
Results
