Структурно-ориентированное проектирование и разработка новых ингибиторов циклофилина А и производных ганодриола-F: подход в силико
23 июня 2026 г.
Здесь мы представляем протокол структуроориентированного проектирования взаимодействия связывания белка и лиганда между санглифрином A и циклофилином A/Ганодриол-F, необходимым для открытия новых препаратов. Стабильность комплекса лиганд-рецепторов оценивалась с помощью молекулярно-динамического моделирования.
Эти исследования сосредоточены на разработке новых ингибиторов циклофилина А и антипролиферативных средств роли ган-ит, направленных на ось циклофилина DCDK и ингибирования пролиферации рака клеток. Ключевые задачи включают достижение оптимального геометрического взаимодействия лиганд-рецептор и поддержание стабильных комплексов лиганд-белков в динамических экспериментальных и физиологических условиях. Для начала откройте файл 1NMK".
Найдите аминокислоту аргинин в позиции номер 55 и запишите координаты X, Y и Z в интерфейсе AutoDock. Откройте меню «Файл», выберите «Чтение молекул». Выберите файл 1NMK" и нажмите Открыть.
Добавьте атомы водорода, выбрав Редактировать, Водород и нажав Добавить. Затем выберите Polar Only» и подтвердите с помощью OK. Затем снова зайдите в меню «Редактировать», выберите «Атомы» и выберите «Назначить тип атома AD4». Далее выберите «Заряды» и выберите «Заряды Коллмана».
Сохраните подготовленный рецептор как 1NMK. pdbqt" выбрав Файл, выбрав Сохранить, установив тип файла и подтвердив местоположение сохранения. Далее откройте меню Ligand, выберите Input.
Нажмите «Открыть», выберите файл PDB и снова нажмите «Открыть». Когда появится информационное окно, просмотрите детали лиганда. Чтобы определить корень лиганда, выберите Лиганд, затем Торсионное дерево и нажмите Определить корень.
Сохраните лиганд, выбрав Ligand, Output и нажав Save as PDBQT. Подготовьте рецепторную сетку, выбрав Grid, Macromolecule, 1NMK и нажав Molecule. Подтвердите предупреждение и сохраните как 1NMK.pdbqt.
Для настройки типов карт выберите Сетку, затем Набор типов карт, Лиганд. Выберите Лиганд — и наконец — Лиганд — снова. Затем определите центр сетки, выбрав Grid, выбрав Grid Box и нажав Center.
Затем выберите атом и введите координаты сетки. Сохраните параметр сетки в виде GPF-файла. Настройте стыковку, выбрав Docking, затем Macromolecule" и Set Rigid File Name.
Перейдите к нужной папке и нажмите 1NMK.pdbqt., чтобы открыть её, выберите Стыковка, выберите Вывод, нажмите Ламарковский GA и сохраните файл параметра стыковки как 1NMK.dpf. В терминале Cygwin введите cd C:и нажмите Enter; Затем введите CD Project и снова нажмите Enter.
Далее введите cd molecules и нажмите Enter. Затем введите cd 3" и нажмите Enter. Введите команду AutoGrid" для генерации карт сетки и нажмите Enter для запуска AutoGrid.
После выполнения — тип хвоста f 1NMK. GLG» и нажмите Enter, чтобы просмотреть ход журнала, введите команду для симуляции молекулярного стыковки. Чтобы сгенерировать файл журнала стыковки, нажмите Enter, чтобы запустить AutoDock.
Затем — тип хвоста f 1NMK. DLG" и нажмите Enter, чтобы отслеживать процесс стыковки. После создания всех DLG-файлов перейдите в папку 1 и откройте DLG-файл в WordPad, нажмите Ctrl+F.
Введите ключевое слово поиска и нажмите Enter три раза, чтобы попасть в таблицу RMSD. Скопируйте энергию связывания и соответствующую информацию о запуске для каждой молекулы из таблицы RMSD, собрать топ-20 молекул в таблицу с столбцами, отмеченными для серийного номера, минимальной энергии связывания, и запускать. В терминале Cygwin перейдите к папке конкретных молекул в каталоге проекта.
Введите команду для извлечения докованных лигандовых координат из DLG и обрезания данных. Нажмите Enter ещё раз, чтобы завершить процесс, подтверждая создание файла PDBQT"файла для запуска 1NMK. Проверьте, что файл 1NMK run PDB создан в той же папке.
Далее откройте программное обеспечение PyMOL 2.5"" и AutoDock" с рабочего стола, откройте файл рецептора, чтобы выбрать структуру рецептора для визуализации. Откройте соответствующий конфигурационный файл лиганда для выбранной молекулы и отобразите загруженный лиганд в 3D-рабочем пространстве. Выберите «Скрыть всё» из меню, импортируйте файл в Maestro, чтобы визуализировать структуру, а затем нажмите «Взаимодействие с лигандом», чтобы получить диаграмму взаимодействия лигандов.
Откройте программное обеспечение UCSF Chimera" с рабочего стола. Выберите Файл, затем Открыть. Ориентируйся к движению C, проектированию и молекулам.
Выберите файл 1NMK. pdb" и нажмите Открыть. В меню выберите Residue и UNL Zoom, чтобы сосредоточиться на области остатков UNL.
Выберите Зону. Затем нажмите «OK» для подтверждения. Далее выберите Действие.
Выберите Label, затем Residue и Name Plus Specifier, чтобы обозначить остатки. Откройте инструменты, выберите Structure Analysis, затем нажмите FindHBond. В стандартном окне настроек FindHBond отметьте галочки цвета H-связей, не соответствующих точным критериям, и найдите H-связи только с выбранными.
Очистите выбор зоны, чтобы начать новое обследование. Затем выберите параметры зоны, увеличите изображение молекулярного дисплея и наблюдайте синие и оранжевые линии, обозначающие водородные связи. Наконец, изучите визуализированную структуру и подсчитайте общее количество видимых водородных связей.
Подтверждение стыковки комплекса лиганд-рецепторов было визуализировано с помощью PyMOL 2.5, показав, что 109 гидрокси-шесть гидроксиэтил связаны в активном кармане 1NMK"рецептора. 4-гидроксиманделический лиганд образует водородные связи с 1NMK"рецептором, особенно с аргинином-55 на расстоянии 1,53 ангстрема. Двумерный структурный анализ иллюстрировал аминокислоты, с которыми лиганды взаимодействуют через водородные связи.
Молекулярно-динамические симуляции подтверждают стабильность комплекса лиганд-рецептор, анализируя радиус вращения более 1000 пикосекунд. График RMSD показал стабильную стабилизацию комплекса через одну наносекунду симуляции, что свидетельствует о устойчивом связывании белка и лиганда. Средняя плотность системы составляла примерно 1019 килограммов на кубический метр, что подтверждает равновесие при условиях NVT, а давление в системе остаётся стабильным во время уравновешения NPT в течение 100 пикосекунд.
Температура стабилизировалась примерно на 300 кельвинов во время фазы NVT, что подтвердило успешное термическое уравновесение. После симуляции была визуализирована траектория комплекса лиганд-белок, показывая распределение молекул воды вокруг стыкованного комплекса. Немногие исследования изучают антипролиферативное средство роль ган-ит-роли как онкогенную терапевтическую мишень.
Этот протокол устраняет этот пробел, разрабатывая и проверяя ингибиторы с помощью молекулярного стыковки и динамического анализа. Наш протокол объединяет несколько вычислительных инструментов в единый рабочий процесс, обеспечивая всесторонний анализ лиганд-белков или рецепторов. Наши будущие исследования будут сосредоточены на валидации этих ингибиторов in vitro и in vivo, изучая пограничное применение ингибиторов циклофилина А на различных типах раковых клеток.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Данное исследование посвящено разработке и валидации новых ингибиторов циклофилина А, воздействующих на ось циклофилин D-CDK для подавления пролиферации раковых клеток. Используя подход, основанный на анализе структуры, исследователи разработали 117 молекул лигандов и оценили их взаимодействие с ферментным рецептором Sanglifehrin A (1NMK) с помощью молекулярного докинга и simulating динамики. Рабочий процесс объединял несколько вычислительных инструментов для оптимизации связывания лиганда с рецептором, оценки стабильности и определения ключевых взаимодействующих остатков для потенциальной разработки противораковых препаратов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Фармакология рака
- Компьютерный дизайн лекарств
- Молекулярный докинг и симуляция
Обзор
- Циклофилин А (Cyp A) участвует в прогрессировании рака посредством регуляции пролиферации и выживаемости клеток.
- Ось Циклофилин D-CDK представляет собой перспективную терапевтическую мишень в онкологии.
- Производные ганодериола F продемонстрировали потенциал в качестве онкогенных мишеней для нескольких типов рака.
- Точное прогнозирование взаимодействий лиганд-рецептор требует надежного компьютерного моделирования.
Цель исследования
- Разработать новые ингибиторы циклофилина A с использованием методов структурного дизайна.
- Оценить аффинность связывания лиганд-рецептора и геометрическую совместимость с помощью докинга.
- Подтвердить стабильность комплекса посредством simulations молекулярной динамики.
- Идентифицировать ключевые аминокислотные остатки, участвующие в образовании водородных связей с ведущими лигандами.
Используемые методы
- Chemsketch для построения 117 новых молекул лигандов-ингибиторов циклофилина.
- AutoDock 4.2.6 для докинга лигандов с белком с целью определения оптимальной геометрии связывания.
- PyMOL 2.5 для визуализации поз докинга и взаимодействий лиганд-рецептор.
- Chimera и Maestro для обнаружения и анализа водородных связей.
- Gromacs с силовым полем CHARMM 36 для моделирования молекулярной динамики комплекса лиганд-рецептор.
Основные результаты
- Аргинин 55 в рецепторе 1NMK образовал водородную связь с лигандом на расстоянии 1,53 Å.
- Ключевые взаимодействующие остатки включали Asn, Gly, Thr, Lys, Ile, His, Phe и Cys.
- Лиганд образовал 45 водородных связей с рецептором, что указывает на высокий потенциал связывания.
- Центр бокса докинга в рецепторе 1NMK был установлен по координатам X=38,86, Y=10,987, Z=40,734.
- МД-симуляция в Gromacs показала стабилизацию комплекса после 1 ns с постоянными значениями RMSD и радиуса гирации.
- Система сохраняла равновесие в условиях NVT/NPT при средней плотности ~1019 kg/m³ и стабильном давлении и температуре (~300 K).
Выводы
- Разработанный комплекс лиганд-рецептор демонстрирует достаточную стабильность для дальнейшей разработки в качестве противоопухолевого препарата.
- Аргинин 55 играет критическую роль в связывании лиганда в активном центре циклофилина А.
- Интегрированный вычислительный рабочий процесс позволяет успешно идентифицировать перспективные ингибиторы Cyp A.
- Дальнейшая работа будет сосредоточена на валидации in vitro и in vivo на нескольких типах раковых клеток.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Компьютерный дизайн на основе структуры позволяет быстро идентифицировать ингибиторы циклофилина А с оптимизированным связыванием с осью циклофилин D-CDK, которая является валидированной онкологической мишенью. Этот подход снижает вероятность отсева на ранних этапах за счет приоритезации лигандов с высокой прогнозируемой степенью взаимодействия с мишенью и стабильностью комплекса. Данный рабочий процесс способствует идентификации соединений-лидеров путем интеграции докинга, анализа взаимодействий и молекулярной динамики, что позволяет снизить риски при проверке механистических гипотез до этапа синтеза.
Стратегическое применение в исследованиях и разработках биофармацевтики
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем моделирования взаимодействий лигандов с циклофилином А с атомным разрешением.
- Операционная ценность: способствует функциональной валидации мишени за счет прогнозирования аффинности связывания и участия ключевых остатков, таких как arginine 55.
- Прогностическая ценность: повышает уверенность в модуляции мишени путем идентификации лигандов, образующих множество водородных связей, включая 45, наблюдаемых в ведущем комплексе.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность к анализу: позволяет создавать валидированные комплексы лиганд-рецептор, подходящие для разработки биохимических или биофизических методов анализа.
- Воспроизводимость: стандартизирует параметры докинга (центр сетки: X=38.86, Y=10.987, Z=40.734) и скоринг для обеспечения согласованности виртуального скрининга.
- Масштабируемость: поддерживает оценку обширных библиотек лигандов (создано 117 молекул) с использованием автоматизированных рабочих процессов докинга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: Внимание сосредоточено на циклофилине A, который играет роль в пролиферации и выживании раковых клеток при различных типах опухолей.
- Трансляционная преемственность: Обеспечивает механистический переход от дизайна in silico к будущей валидации in vitro и in vivo.
- Снижение рисков: Оценка стабильности комплекса с помощью RMSD и радиуса гирации, что позволяет принимать решения о целесообразности дальнейшей работы до синтеза соединений.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум процесса поиска новых лекарств — от валидации мишени до идентификации ведущих соединений, обеспечивая возможность компьютерного отбора перед проведением лабораторных испытаний.
- Открывающая биология: проверка терапевтических гипотез путем моделирования ингибирования функций циклофилина А лигандами в оси D-CDK.
- Скрининг: получение готовых к анализу данных с помощью стандартизированных поз докинга и ранжирования по энергии связывания для приоритизации соединений.
- Аналитика: предоставление количественных показателей (энергия связывания, количество водородных связей, RMSD) для сравнения эффективности лигандов и оптимизации.
- Трансляционные исследования: связь компьютерно-выявленных хитов с доклиническим этапом путем подтверждения стабильности комплекса в ходе симуляции длительностью 1000 ps.
- Корпоративное повторное использование: создание переиспользуемого конвейера для воздействия на другие белок-белковые взаимодействия с использованием той же интеграции инструментов (Chemsketch, AutoDock, PyMOL, Gromacs).
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Механистическое снижение рисков за счет прогнозирования взаимодействий лиганд-рецептор и идентификации критических остатков связывания.
- Операционная ценность: Стандартизация рабочего процесса между инструментами снижает вариабельность и обеспечивает межкомандное взаимодействие.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет фильтрации соединений на основе прогнозируемой стабильности и степени взаимодействия с мишенью.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию хемотипов с учетом рисков на основе высоких показателей докинга и стабильности, подтвержденной методом молекулярной динамики (MD).
Особенности реализации
- Опыт работы с молекулярным моделированием, программным обеспечением для докинга (AutoDock) и платформами для симуляции (Gromacs).
- Доступ к вычислительной инфраструктуре для генерации сеток, докинга и МД-симуляции белок-лигандных систем.
- Стандартизация протоколов подготовки лигандов, назначения зарядов (Kollman) и сохранения параметров сетки.
- Особенности адаптации для различных рецепторных систем, помимо 1NMK, включая перецентрирование бокса сетки и анализ конкретных остатков.
- Ограничения включают зависимость от точности силового поля (CHARMM 36) и временных масштабов симуляции для регистрации редких событий связывания.
