Заражение сосен in vivo и in vitro сосновой нематодой Bursaphelenchus xylophilus и выделение индуцированных летучих веществ
27 сентября 2024 г.
В протоколе описывается инфекция сосновой нематодой Pinus pinaster in vivo и in vitro и анализ их волютилома с помощью газовой хроматографии (ГХ) и ГХ в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ-МС).
Мы создали систему совместного культивирования in vitro побегов сосны с нематодами соснового леса для сбыта и изучили изменения в летучем ответе хозяина на этих фитопаразитов. Тепличные биодома позволяют контролировать изменчивость окружающей среды. Тем не менее, генетическое разнообразие саженцев сосны по-прежнему влияет на результирующие летучие профили.
Побеги сосны in vitro, зараженные нематодами сосны, позволяют брать образцы легко получаемых клонов растений, что снижает влияние изменчивости, обусловленной генетическим разнообразием сосны. Растительные летучие вещества выделяются путем гидродистилляции при дистилляционной экстракции, но методы свободного пространства позволяют профилировать летучие вещества, выделяемые установкой. Колонки, наполненные смолой, будут использоваться в качестве неинвазивного метода для профилирования летучих веществ, выделяемых in vitro наземной сосной, зараженной сосновой нематодой, для прямого анализа химического взаимодействия между хозяином и фитопаразитом.
Обзор
В данном исследовании представлен подробный протокол изучения взаимодействия между сосновой нематодой и Pinus pinaster как in vitro, так и in vivo. Особое внимание уделяется анализу летучих органических соединений, выделяемых зараженными соснами, что позволяет прояснить ответ хозяина на воздействие этих фитопаразитов.
Основные компоненты исследования
Область исследований
- Инфицирование сосновой нематодой
- Анализ летучих органических соединений
- Взаимодействия растений и патогенов
Теоретическая часть
- Генетическое разнообразие проростков сосны влияет на профили летучих соединений.
- Системы совместного культивирования in vitro обеспечивают контролируемую среду для снижения вариабельности.
- Понимание реакций хозяина имеет решающее значение для борьбы с увяданием сосны.
Используемые методы
- Системы совместного культивирования побегов сосны и нематод in vitro
- ГХ и ГХ-МС для анализа профиля летучих веществ
- Биотесты в тепличных условиях для количественной оценки симптомов
Основные результаты
- Установление стократного увеличения популяции нематод в течение восьми дней.
- Признаки болезни увядания сосны, наблюдаемые через 20 дней после инокуляции.
- Успешное выделение летучих веществ из инфицированных тканей.
Выводы
- Данный протокол расширяет наше понимание реакций растений на инфекцию нематодами.
- Полученные результаты вносят вклад в более широкую область патологии растений и нематологии.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Модели контролируемого заражения Pinus pinaster нематодой Bursaphelenchus xylophilus позволяют детально изучать взаимодействия между хозяином и патогеном, а также обнаруживать летучие биомаркеры. Система совместного культивирования in vitro снижает генетическую и средовую изменчивость, обеспечивая воспроизводимое биохимическое профилирование, которое имеет решающее значение для валидации мишеней на ранних этапах и снижения рисков при изучении механизмов патогенеза. Эти возможности повышают прогностическую достоверность в трансляционной фитопатологии и при принятии решений в рамках разработки биофармацевтических препаратов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет провести механистический анализ ответа хозяина на воздействие фитопаразита в контролируемых условиях.
- Снижает влияние мешающей генетической вариабельности, что способствует надежной валидации мишеней и проверке гипотез.
- Облегчает идентификацию летучих биомаркеров, связанных с прогрессированием заболевания или устойчивостью к нему.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированные системы in vitro для воспроизводимых рабочих процессов экстракции и анализа летучих веществ.
- Поддерживает количественное профилирование летучих веществ растений с использованием методов гидродистилляции и SPME.
- Позволяет проводить масштабируемый скрининг взаимодействий между хозяином и патогеном для оценки соединений или генетических исследований.
Трансляционные и доклинические исследования
- Связывает поиск летучих биомаркеров с трансляционными исследованиями устойчивости растений к болезням.
- Обеспечивает преемственность результатов, полученных в контролируемых условиях in vitro, при их валидации in vivo в тепличных моделях.
- Снижает риски при продвижении кандидатных биомаркеров или стратегий вмешательства за счет предоставления воспроизводимых данных.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данная методика связывает этап ранних открытий и трансляционные исследования, обеспечивая возможность контролируемого заражения, анализа летучих соединений и идентификации биомаркеров как в системах in vitro, так и in vivo для сосны.
- Открывающая биология: Поддерживает гипотетическое исследование химического взаимодействия между хозяином и патогеном и выяснение механизмов передачи сигналов.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимые количественные показатели летучих соединений для сравнительного анализа различных условий.
- Аналитика: Использует гидродистилляцию, дистилляционную экстракцию и SPME для надежного измерения летучих веществ и статистического сравнения.
- Трансляционные исследования: Способствует сопоставлению результатов in vitro с моделями заболеваний in vivo для валидации биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: Создает стандартизированную масштабируемую платформу для текущих исследований взаимодействия растений и патогенов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность в исследованиях взаимодействия хозяина и патогена.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и пропускную способность рабочих процессов анализа летучих соединений.
- Стратегическая ценность: служит основой для принятия решений о целесообразности (go/no-go) дальнейшей разработки биомаркеров или методов вмешательства, повышая эффективность использования капитала.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию потенциальных биомаркеров и стратегий обеспечения устойчивости к заболеваниям с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области культуры тканей растений, работы с нематодами и методов экстракции летучих соединений.
- Необходим доступ к камерам с контролируемыми условиями окружающей среды и аналитическому оборудованию для профилирования летучих веществ.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов заражения, отбора проб и анализа.
- Адаптация к другим системам «растение-патоген» может потребовать оптимизации протокола с учетом видоспецифических переменных.
- Вариабельность выхода летучих веществ может зависеть от количества растительного материала и эффективности экстракции.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:09
In Vitro Cultivation and Maintenance of Pinewood Nematodes Using Botrytis cinerea
2:40
In Vivo Infection Process of Pinus pinaster Seedlings with Pinewood Nematodes
4:11
Establishment and Infection of In Vitro Pinus pinaster Shoot Cultures with Pinewood Nematodes
6:57
Isolation of Volatile Compounds from Pinus pinaster Seedlings Using Headspace Trapping with Packed Tubes
