Выделение хондроцитов и хондропрогениторов с помощью анализа адгезии фибронектина и миграции

В области инженерии хрящевой ткани и регенеративной медицины по-прежнему существует потребность в улучшении биологических и функциональных результатов с точки зрения улучшения текущего лечения и разработки новых терапевтических стратегий. Текущие доклинические исследования указывают на потенциальное использование хондропрогениторов, полученных из хрящей, в качестве жизнеспособного варианта для заживления хрящей. Текущие исследования включают стратегии дальнейшего повышения хондрогенного потенциала при сохранении более низкой гипертрофической потенции за счет использования дополнительных факторов роста и методов рекомбинантной обработки генов.

Хондропрогениторы сталкиваются с экспериментальными проблемами, включая отсутствие консенсуса по номенклатуре, различные методы выделения, трудности с характеризацией, изменчивость условий культивирования и ограниченное понимание основных механизмов. Клиническая демонстрация того, что хондропрогениторы дают положительные результаты по сравнению с обычно используемыми клетками, может значительно снизить глобальную нагрузку, связанную с патологиями, связанными с хрящом. Эволюция улучшенных терапевтических средств с использованием бесклеточных альтернатив, таких как внеклеточные везикулы, полученные от предшественников, и с использованием рекомбинантных стратегий для регенерации подлинного гиалиноподобного хряща.

Для начала получите большеберцово-бедренные или коленные суставы от доноров человека в 1X PBS в стерильных условиях, затем перенесите собранные суставы на стерильную подкладку в капюшоне. Чтобы стабилизировать суставы, держите субхондральную кость хрящом вверх. С помощью лезвия скальпеля No 22 соберите хрящевую стружку прямоугольной формы из областей, не несущих вес.

Разрежьте хрящ на участки размером восемь миллиметров на 10 миллиметров от поверхностного слоя к более глубокому. После промывки ломтиков PBS поместите их в чашку Петри, содержащую от одного до двух миллилитров простой модифицированной Dulbecco Eagle's medium или DMEM. Далее, используя лезвие скальпеля под номером 22, измельчите хрящевые срезы до размера меньше одного миллиметра в кубе.

Для начала получите измельченный хрящ из извлеченных коленных суставов человека. Поместите измельченный хрящ в вертикальную колбу T25, содержащую 10 миллилитров бессывороточного DMEM/F-12 с 0,15% коллагеназы типа II для ферментативного переваривания. Оставьте колбу в покое в инкубаторе с углекислым газом на 12-14 часов.

После ночного разложения переложите среду, содержащую высвобождающиеся хондроциты, в свежую стерильную центрифужную пробирку. Используйте ситечко для клеток, чтобы отделить клетки от мусора. Добавьте равный объем DMEM/F-12 с 10% фетальной бычьей сывороткой или FBS.

Центрифугируйте отфильтрованные ячейки при 1200 G в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия. После удаления надосадочной жидкости восстановите гранулу в одном миллилитре среды. Подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью теста исключения трипанового синего.

Затем загрузите хондроциты в колбу Т25 в концентрации 10 000 клеток на квадратный сантиметр. Разверните ячейки до необходимого проходного номера с помощью DMEM/F-12, содержащего 10% FBS. Обновляйте среду каждые три дня перед забором клеток в субконфлюенции, используя 0,125% трипсина, содержащего ЭДТА.

Хондроциты прилипали сразу после загрузки и переходили от округлой булыжной формы к фибробластическому виду по мере расширения. Для начала получите хрящевую стружку из экстрагированных большеберцовых или коленных суставов человека. Подвергните хрящевую стружку последовательному ферментативному разложению в течение ночи, сначала используя 0,2% проназы в течение трех часов, а затем 0,04% коллагеназы типа II в течение 12 часов на встряхивающей водяной бане, поддерживаемой при температуре 37 градусов Цельсия.

Затем покройте необходимое количество лунок шестилуночного планшета 1,5 миллилитрами раствора фибронектина PBS. Плотно закройте тарелку и поставьте в холодильник на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день достаньте из холодильника шестилуночную пластину, покрытую фибронектином.

После удаления избытка фибронектина добавьте два-три миллилитра простой среды DMEM/F-12 в лунки с покрытием. Высвобождайте высвобождающиеся хондроциты в лунки с покрытием с плотностью 4000 клеток на лунку и оставляйте планшет в покое в течение 20 минут. После инкубации аспирируйте избыток среды и неадгезивные клетки.

Добавьте в лунки два-три миллилитра DMEM/F-12 с 10% фетальной бычьей сывороткой. Поддерживайте адгезивные клетки в стандартных условиях культивирования в течение 10-12 дней для получения клонов хондрогенных клеток-предшественников, или CPC, затем изолируйте клоны CPC с использованием 0,125% трипсина ЭДТА в течение 180 секунд, затем повторите воспроизведение в соотношении один клон на пять квадратных сантиметров. Разверните обогащенные поликлональные ЦПК до требуемого слияния.

Хондроциты, подвергнутые анализу адгезии фибронектина, демонстрируют клональный рост, достигая удвоения популяции до пяти к 10-му дню. Для начала получите выбритые хрящевые экспланты из собранного суставного сустава в дополненной среде DMEM/F-12. Поместите тарелку с эксплантами внутрь инкубатора с углекислым газом, установленного при температуре 37 градусов Цельсия, на 48 часов.

Через два дня переложите экспланты в центрифужную пробирку, содержащую 10 миллилитров 0,1% раствора коллагеназы для ферментативного расщепления. Инкубируйте пробирку при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов. После сбраживания промойте экспланты с помощью 1X PBS и верните их в те же лунки в тарелке, где содержится свежая добавка среды DMEM/F-12.

Поддерживайте планшет в инкубаторе в стандартных условиях культивирования и следите за миграцией хондропрогениторов в течение последующих дней. Как только экспланты достигнут субконфлюенции, соберите мезенхимальные хондропрогениторные клетки, или МКП, используя 0,125% раствор трипсина ЭДТА. Расширить ГКП с помощью дополненной среды DMEM/F-12.

Хондропрогениторы начинают мигрировать с края экспланта к 10-му дню культивирования, демонстрируя веретенообразный характер роста с дальнейшим расширением.