Скрининг ковалентных фрагментов с использованием количественного анализа необратимого привязки

Мы сотрудничаем с кафедрами химии и медико-биологических наук, разрабатывая новые вспомогательные ковалентные лиганды для целого ряда мишеней противораковых препаратов. Есть надежда, что эти молекулы будут использоваться в будущем либо в качестве терапевтических средств, либо, возможно, в качестве химических зондов. Таким образом, существует несколько технологий для скрининга ковалентных лигандов.

Они могут быть разделены на протеомные методы, с помощью которых соединения инкубируются с культивируемыми клетками, и масс-спектрометрию, используемую для определения того, какие белки помечают молекулы, и методы, основанные на мишенях, когда библиотеки электрофилов инкубируются с отдельными белками. Значительная экспериментальная проблема связана с реакционной способностью ковалентных лигандов. Чрезмерно реактивные молекулы часто появляются в качестве хитов во время скрининговых анализов, но они не подходят, поскольку они будут неизбирательно помечать множество различных белков в клетке.

Таким образом, соединение активности имеет решающее значение для рассмотрения на каждом этапе разработки ковалентных лекарств. Поэтому группы Манна и Армстронга из Imperial разработали новый метод скрининга электрофилов против белковой мишени, называемый количественным необратимым связыванием или qIT анализом. Наш протокол обеспечивает столь необходимый новый метод скрининга электрофилов по белковой мишени, который является масштабируемым, не требует масс-спектрометрии и контролирует внутреннюю реактивность соединения.

Для начала приготовьте все необходимые исходные растворы и оставьте их при комнатной температуре на два часа до начала эксперимента. Дегазация количественного, необратимого привязывания или буфера для анализа qIT с газообразным аргоном в течение примерно 30 минут. Для осуществления буферного обмена разбавьте белковый раствор сверх дегазированного буфера qIT в фильтрующем блоке и вращайте при 4000 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия для концентрации белка.

Затем разбавьте раствор целевого белка до концентрации 15 микромоляров в дегазированном буфере для анализа qIT до получения девяти миллилитров раствора. Диспонируйте раствор TCEP-аграозы, буфер qIT и запас глутатиона в соответствующие лунки 384-луночных планшетов. Перелейте 1,8 микролитра из каждой соответствующей лунки библиотечного планшета для фрагментов, чтобы создать планшет для разбавления соединения, разбавив каждое соединение до 1,5 миллимоляра в буфере для анализа qIT, плюс 3% ДМСО.

Используйте пипетирующую станцию 384 для переноса 20 микролитров раствора соединения из каждой лунки планшета для разбавления соединения в оба реакционных планшета. Для начала настройте количественный необратимый привязной анализ или qIT с нужным белком и глутатионом. Распределите 500 микромоляров CPM по 111,2 микролитровых аликвот в микроцентрифужных пробирках и храните их при температуре 20 градусов Цельсия.

После размораживания запаса CPM добавьте его в 40 миллилитров буфера для гашения qIT для приготовления 1,4 микромольного раствора Распределите по 27 микролитров раствора CPM Quench в каждую лунку из двух свежих 384-луночных планшетов. Центрифугируйте белковую реакционную пластину при 200 Г в течение трех минут, чтобы гранулировать TCEP-агарозу. В заранее определенные моменты времени используйте станцию дозирования 384 для переноса трех микролитров образца из каждой лунки белковой реакционной пластины на закалочную пластину CPM.

Извлекайте пробу из верхней части лунки, избегая аспирации ТЦЭП-агарозы на дне. Инкубируйте закалочные пластины CPM при комнатной температуре в течение одного часа и измерьте интенсивность флуоресценции с возбуждением на 384 нм и излучением на 470 нм. Для начала выполните количественно-необратимый привязной анализ или анализ qIT с нужным белком и закалите образцы в планшете CPM.

Для каждой закалки рассчитайте простое число Z как меру качества анализа. Затем рассчитали средние значения флуоресценции для отрицательных контрольных лунок в первой и второй колоннах и положительных контрольных лунок в столбцах 23 и 24. Хорошо нормализовать каждую реакцию до средних значений флуоресценции положительного и отрицательного контроля и отдельно построить график зависимости процента модифицированного от времени для каждого соединения, реагирующего с глутатионом и с белком-мишенью.

Используя GraphPad, подгоньте нормализованные процентные данные о зависимости от времени к однофазной модели экспоненциального распада для обеих реакций, используя уравнение AE в степени KT C. Используйте скорость, с которой фрагменты реагируют с белком и глутатионом, чтобы рассчитать коэффициент увеличения скорости или значение REF для каждого фрагмента. Наконец, чтобы выбрать фрагменты попадания, установите порог REF, произвольный коэффициент попаданий или выберите фрагменты с REF на три стандартных отклонения больше среднего геометрического. Соединение 1 реагировало с остатком цистеина на белке-мишени в шесть раз быстрее, чем с глутатионом, удовлетворяя критерию Hit REF больше трех.

Соединение 2 не показало ускоренной скорости реакции с остатком цистеина-мишени по сравнению с глутатионом, что указывает на отсутствие продуктивных нековалентных взаимодействий и, следовательно, не было выбрано в качестве хита.