Количественная оценка митохондриального дыхания в цельных дрожжевых клетках

Митохондриальное дыхание является основным генератором клеточной энергии в большинстве случаев и важным показателем клеточного метаболизма и физической формы. Таким образом, функции митохондрий определяют биоэнергетическое клеточное состояние. Этот протокол описывает метод количественной оценки митохондриального дыхания в G-живых клетках в качестве биоэнергетического параметра.

Методика, описанная в этом протоколе, помогает нам определить биоэнергетический механизм некоторых полифенолов, таких как ресвератрол и коирцитен. Он также служит инструментом для измерения метаболизма пентозы, в том числе ПТПТ и объясняет биоэнергетические изменения за деревом кабины и эффекты наземных работ. Нас интересует расшифровка того, как клетки приобретают некоторые фенотипы, такие как эффект дерева и работы на земле, со значительными изменениями в клеточной биоэнергетике.

Митохондриальное дыхание является важным инструментом для выяснения молекулярных механизмов, лежащих в основе этого метаболического феномена. Для начала закиньте 10-миллилитровую стеклянную пробирку, содержащую три миллилитра среды YPD, 250 микролитрами дрожжевых клеток, сохраненных в глицерине. Инкубируйте пробирку в течение ночи при температуре 30 градусов Цельсия при постоянном перемешивании со скоростью 200 оборотов в минуту.

Затем, используя стерильную петлю, проденьте на шнековую пластину YPD дрожжевые клетки, выращенные в стеклянной пробирке объемом 10 миллилитров. Инкубируйте чашку Петри при температуре 30 градусов Цельсия до тех пор, пока не появятся изолированные колонии. Чтобы приготовить предварительный инокулюм, введите три миллилитра среды YPD с содержанием глюкозы 2% в две или три изолированные колонии дрожжей и инкубируйте.

Затем получите 100 миллилитров стерильной синтетической готовой среды в колбе Эрленмейера объемом 500 миллилитров. Заквашивайте среду культурой дрожжей перед посевом в течение ночи с начальной оптической плотностью 0,1 при 600 нанометрах. Добавьте к этому химическое вещество, такое как 100 микромолярный ресвератрол, чтобы проверить митохондриальное дыхание.

Затем налейте ячейки средней логарифмической фазы в пустую, предварительно взвешенную коническую пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте ячейки при 4000 G в течение пяти минут. После сброса надосадочной жидкости трижды промойте гранулу 25 миллилитрами деионизированной воды. Взвесьте коническую трубку, содержащую промытую гранулу, чтобы получить влажный вес, вычтя вес пустой трубки.

Затем повторно суспендируйте промытую гранулу в двух миллилитрах деионизированной воды. Для начала дрожжевые клетки обработают соответствующими препаратами, такими как ресвератрол. Поместите пять миллилитров 10 миллимолярного буфера MES-TEA и 50 миллиграммов влажных клеток в камеру полярного трансплантата.

Осторожно расположите кислородный электрод типа Кларка, убедившись, что на нем не образуются пузырьки. Включите монитор YSI 5300A и компьютер сбора данных. Выберите диск настройки первого канала на воздух и отрегулируйте первый канал на 100% с помощью диска калибровки первого канала.

Начните записывать данные и начинайте измерять время с помощью хронометра. С помощью шприца для хроматографии добавьте окисляемый субстрат до конечной концентрации 10 миллимоляров и держите камеру закрытой при постоянном перемешивании. Затем, используя шприц для хроматографии, добавьте олигомицин для получения конечной концентрации 0,01 миллимоляра в камере оксиметра и зарегистрируйте процентное потребление воздуха.

Аналогичным образом добавьте CCCP к конечной концентрации 0,015 миллимоляра в камере оксиметра для определения максимальной дыхательной способности. Затем добавьте ингибиторы цепи переноса электронов, трифлурозитон зуба и масла, или TTFA, в количестве одного миллимоля, а затем антимицин А в дозе один миллиграмм на миллилитр. Промойте камеру три раза с 70% этанолом, а затем деионизированной водой, прежде чем перейти к следующему источнику углерода.

Для начала проведите анализ потребления кислорода дрожжевыми клетками, используя различные источники углерода и контроль. Создайте новый файл проекта в статистической программе и выберите XY в разделе создания. Затем нажмите клавишу ввод или импортируйте данные в новую таблицу в разделе таблицы данных.

В разделе опций выберите числа в подразделе X и в подразделе Y. Нажмите на кнопку Введите три повторяющихся значения в параллельных подстолбцах. Введите данные о времени в столбцы X и введите данные о процентном соотношении воздуха в столбцы Y.

Чтобы выполнить анализ линейной регрессии, нажмите кнопку «Анализ» в строке меню и в разделе «Анализ» выберите «Простая линейная регрессия в анализе XY», затем нажмите кнопку «ОК». Получите значение уклона из раздела результатов в таблицах данных. Скопируйте рассчитанные значения уклона в таблицу данных.

Вычтите значение наклона, полученное от ингибиторов дыхания Смешайте из ингибиторов окисляемого субстрата, олигомицина и CCCP, чтобы отбросить другие источники потребления кислорода. Теперь умножьте значения наклона на 237 микромоляров кислорода, что представляет собой растворимость кислорода в этом состоянии, и буфер. Преобразуйте значения в микромоляры кислорода в минуту, корректируя в соответствии со временем на графике.

Разделите результаты на 50, представляя миллиграммы клеток, использованных в эксперименте. Наконец, потребление кислорода выражается в микромолярах кислорода на миллиграмм клеток в минуту. Клетки, выращенные с содержанием глюкозы 0,5%, показали значительно более высокое потребление кислорода при базальном дыхании, дыхании, связанном с АТФ, и максимальную дыхательную способность по сравнению с клетками, выращенными с содержанием глюкозы 5%.

Кверцетин значительно снижал митохондриальное дыхание в клетках, выращенных с 0,5% глюкозы, влияя на базальное, АТФ-сцепленное и максимальное дыхание. С другой стороны, кверцетин существенно не влиял на митохондриальное дыхание в клетках, выращенных с содержанием глюкозы 5%.