Оптимизированная и упрощенная технология производства и культивирования прецизионно нарезанных ломтиков печени

Протоколы производства и культивирования прецизионно нарезанных ломтиков печени (PCLS) могут сильно различаться. Основным недостатком PCLS является их короткий период полураспада, но здесь мы демонстрируем, что производство и культивирование PCLS может быть достигнуто в стандартных лабораторных условиях с доступом к вибратому, обеспечивая при этом период полураспада не менее четырех дней. PCLS — привлекательная модель, которая заполняет пробелы между моделями in vitro и in vivo, но ими часто пренебрегают из-за их относительно короткого периода полувыведения. Тем не менее, они содержат все типы клеток и сохранившуюся архитектуру, необходимую для метаболического суммирования, и поэтому напоминают мини-модель всего органа, что позволяет изучать и лечить живые ткани, воспроизводя их сложные фенотипы. Непрерывная нарезка — очень простой, но технически сложный процесс. Чтобы облегчить эту задачу, наш протокол фокусируется на ключевых этапах, таких как ориентация разреза и встраивание ткани, а также на значимости объема мини-модели для культивирования и динамической системы для увеличения периода полувыведения.

[Рассказчик] Перед сбором урожая подготовьте один литр буфера Krebs-Henseleit, продезинфицированный и охлажденный поддон для вибратома, автоклавные лопасти вибратома и 4% легкоплавкую агарозу. В день сбора урожая держите растопленную агарозу на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия до использования. Затем подготовьте культуральные планшеты, добавив 2,6, 1,5 и 0,7 миллилитров готовой среды на лунку в шести-, 12- и 24-луночные планшеты соответственно. В каждую лунку вставьте пористые вставки толщиной восемь микрометров. Поместите пластины в увлажненный инкубатор, установленный на температуру 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа и 21% кислорода. Стерилизуйте все инструменты, необходимые для сбора урожая, используя соответствующие методы стерилизации. Опрыскайте брюшную полость усыпленной мыши 70% этанолом, чтобы продезинфицировать область. С помощью стерильных щипцов и ножниц разрежьте кожу и брюшину от середины живота, чтобы открыть брюшную полость. Аккуратно рассекайте печень от окружающих органов или сосудов, избегая повреждения долей. Затем сразу же храните целую печень в ледяном буфере Кребса. С помощью тупых щипцов и острого стерильного ножа или ножниц отделите каждую долю по отдельности, чтобы не повредить доли во время разделения. С помощью острого стерильного ножа обрежьте все края выбранной мочки, чтобы создать прямые, управляемые края для заделки. Далее высыпаем 4% легкоплавкую агарозу в трехсантиметровую чашку Петри, помещенную на влажный лед, чтобы равномерно остыть и не дать мочке утонуть. Дайте агарозе остыть еще на 30 секунд, а обрезанную лопасть поместите в центр агарозы, позволив ей осесть в середине блока. Затем отрежьте внешние края агарозного блока и вытащите агарозный блок из блюда. Убедитесь, что верхняя сторона и сторона, приклеенная к платформе вибратома, параллельны верхнему краю лепестка. Начните с установки вибратома на резку толщиной 250 микрометров со скоростью пять и частотой семь герц. После стерилизации вибратома и установки подноса на вибратоме окружите его льдом, чтобы сохранить окружающую среду холодной. Установите лопасти под углом 10 градусов вниз от горизонтальной плоскости. Затем заполните бак с вибратомом ледяным буфером Кребса. Нанесите тонкий слой цианоакрилатного клея на платформу, чтобы подготовить ее к монтажу агарозного блока. После этого просушите край агарозного блока, который будет приклеен к платформе, с помощью стерильной впитывающей ткани. Теперь поместите агарозный блок на съемную платформу вибратома. Расположите долю печени вертикально, чтобы можно было делать поперечные разрезы, что снижает давление на долю и способствует более плавному разрезу. Подождите одну минуту, пока клей схватится, и погрузите платформу в резервуар Vibratome, убедившись, что агарозный блок полностью покрыт буфером Кребса. Чтобы запрограммировать вибратом на резку, установите начальное и конечное положения. Затем начните нарезать ломтики до тех пор, пока не будет достигнута доля печени. Используйте шпатель для сбора срезов печени, так как это позволяет избежать повреждений, в отличие от щипцов или щеток. Соберите ломтики в ледяной буфер Кребса до тех пор, пока они не будут готовы к выращиванию. С помощью шпателя переложите срезы печени в подготовленные лунки, содержащие среды и вкладыши. Затем поместите планшеты на орбитальный вибростенд, установленный на 130 об/мин, и инкубируйте их в обычном инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа и 21% кислорода.