Одномолекулярная визуализация раскручивания ДНК в реальном времени с помощью хеликазы CMG
27 сентября 2024 г.
Этот протокол демонстрирует выполнение анализа одной молекулы для визуализации раскручивания ДНК с помощью хеликазы CMG в реальном времени. В ней описывается (1) получение субстрата ДНК, (2) очистка флуоресцентно меченой геликазы Drosophila melanogaster CMG, (3) подготовка микрофлюидной проточной ячейки для микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF) и (4) анализ раскручивания одномолекулярной ДНК.
В нашей лаборатории мы изучаем молекулярные механизмы репликации эукариотической ДНК. Мы хотим понять динамику дупликации генома на уровне отдельных молекул. Мы визуализируем репликацию ДНК с помощью нескольких систем, включая очищенные белки и экстракт, полученный из яиц Xenopus.
Многое из того, что мы знаем о репликации ДНК, получено в результате массовых экспериментов, визуализации клеток и структурной биологии. Эти методы действительно мощные, но они часто ограничены в том, что они могут рассказать нам о динамике или переходном поведении отдельных белков. Это то, для изучения чего действительно хорошо подходят методы с использованием одной молекулы, и именно поэтому их использование растет в этой области.
Наш протокол для визуализации раскручивания ДНК в реальном времени описывает платформу, которую можно использовать и модифицировать для исследования различных аспектов репликации ДНК. Это может обеспечить лучшее понимание молекулярного механизма активности CMG в присутствии выбранных компонентов рибосом и репликативного стресса. Чтобы понять сложные системы, участвующие в процессе репликации ДНК, мы изолируем ключевые белки и визуализируем их поведение в реальном времени in vitro.
Полученные нами знания способствуют созданию более полной картины репликации ДНК.
Обзор
В данном протоколе представлен одномолекулярный анализ для визуализации расплетения ДНК хеликазой CMG в режиме реального времени. В нем описываются подготовка ДНК-субстрата, очистка флуоресцентно меченной хеликазы CMG и настройка микрофлюидной проточной кюветы для TIRF-микроскопии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология
- Молекулярная биология
Теоретические основы
- Изучение динамики репликации ДНК на уровне отдельных молекул.
- Ограничения экспериментов с суммарными популяциями (bulk experiments) и структурной биологии при изучении переходных состояний белков.
- Значимость методов анализа единичных молекул для раскрытия молекулярных механизмов.
- Анализ активности хеликазы CMG и её взаимодействия с компонентами рибосомы.
Цель исследования
- Визуализировать расплетание ДНК в режиме реального времени.
- Исследовать молекулярные механизмы репликации ДНК эукариот.
- Углубить понимание активности хеликазы CMG в условиях репликативного стресса.
Используемые методы
- Подготовка проточной кюветы с биотинилированным ПЭГ для TIRF-микроскопии.
- Очистка CMG-хеликазы Drosophila melanogaster.
- Визуализация расплетения ДНК в режиме реального времени с использованием флуоресцентных маркеров.
- Анализ влияния повреждений одноцепочечной ДНК на процессы расплетения.
Основные результаты
- Успешная визуализация расплетения ДНК хеликазой CMG.
- Линейный рост участка RPA, указывающий на расплетенные цепи ДНК.
- Наблюдение снижения частоты событий расплетения вследствие повреждения ДНК.
- Представление о динамике механизмов репликации ДНК.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежную платформу для изучения репликации ДНК.
- Методы анализа единичных молекул позволяют получить важные сведения об активности хеликазы.
- Полученные результаты способствуют более глубокому пониманию процессов репликации ДНК.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Визуализация процесса расплетения ДНК хеликазой CMG в реальном времени на уровне отдельных молекул обеспечивает беспрецедентное понимание механистических основ точности репликации генома. Эта возможность позволяет биофармацевтическим исследованиям и разработкам...&Команды D изучают динамику хеликаз, ответы на репликативный стресс и уязвимости путей на молекулярном уровне. Такая механистическая ясность обеспечивает прогностическую уверенность при валидации мишеней и позволяет принимать взвешенные с учетом рисков решения на этапах раннего поиска и в доклинических исследованиях.
Стратегические приложения в биофармацевтических исследованиях&D
Ранний поиск и валидация мишени
- Прямое наблюдение за активностью хеликазы CMG позволяет проводить функциональную валидацию мишеней для компонентов репликационного аппарата.
- Разрешение на уровне отдельных молекул позволяет выявить «узкие места» в путях передачи сигнала и снизить механистические риски при разработке мишеней для репликации ДНК.
- Контроль условий реакции в режиме реального времени способствует проверке гипотез при исследовании ответов на репликационный стресс.
Скрининг и разработка анализа
- Валидированные методы анализа единичных молекул обеспечивают количественные и воспроизводимые показатели активности хеликазы в определенных условиях.
- Стандартизация анализа позволяет надежно сравнивать влияние различных соединений на динамику расплетения ДНК.
- Гибкость платформы позволяет адаптировать ее для скрининга модуляторов стабильности репликационной вилки.
Трансляционные и доклинические исследования
- Механистическое понимание ответов на репликационный стресс обосновывает стратегии трансляционного поиска биомаркеров стабильности генома.
- Преемственность от молекулярного механизма к доклинической модели поддерживает риск-ориентированное продвижение агентов, нацеленных на репликацию.
- Прогностическое снижение рисков при выборе потенциальных методов вмешательства становится возможным благодаря прямому измерению эффективности расплетения ДНК и ответа на повреждения.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Этот метод анализа с использованием одномолекулярной TIRF-микроскопии интегрируется в общий процесс исследований: от ранних этапов изучения механизмов до доклинической валидации терапевтических средств, нацеленных на репликацию.
- Биология открытий: позволяет проверять гипотезы и уточнять пути обеспечения точности репликации ДНК и ответа на стресс.
- Скрининг: обеспечивает количественные, воспроизводимые результаты для оценки влияния соединений на функцию хеликазы.
- Аналитика: позволяет в режиме реального времени проводить одномолекулярные измерения кинетики расплетения и воздействия повреждений.
- Трансляционные исследования: способствует согласованию биомаркеров путем установления связи между молекулярным механизмом и результатами стабильности генома.
- Корпоративное повторное использование: создает многофункциональную платформу для различных исследований репликации и поддержания целостности генома.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней репликации.
- Операционная ценность: стандартизирует рабочие процессы анализа единичных молекул для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости между различными исследовательскими группами.
- Стратегическая ценность: помогает в принятии решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и распределении капитала за счет выявления уязвимых мест в путях репликации.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию программ, нацеленных на репликацию, с поправкой на риск на основе механистических доказательств.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области одномолекулярной флуоресцентной микроскопии и очистки белков.
- Необходимы специализированные приборы, включая микроскоп TIRF и установку с микрофлюидной проточной кюветой.
- Стандартизация между исследовательскими группами необходима для получения воспроизводимых количественных результатов.
- Адаптация к различным модельным системам может потребовать оптимизации ДНК-субстратов и белковых компонентов.
- Пропускная способность анализа и обработка данных могут быть ограничены требованиями к визуализации и ручной настройке установки.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:14
Preparation of a Biotin‐PEG Flow Cell Assembly for Single Molecule Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy
3:41
Single Molecule Total Internal Reflection Fluorescence Assay for Visualizing CMG‐Mediated DNA Unwinding
