Количественная оценка индуцированных сахарным диабетом адгезивных лейкоцитов в сосудистой сети сетчатки

Основное внимание в нашей лаборатории уделяется тому, чтобы узнать, что вызывает ретинопатию при диабете и как ее можно предотвратить. В нескольких лабораториях выявлен лейкостаз, перенакопление лейкоцитов, в мелких сосудах глаза увеличивается сахарный диабет. И это может способствовать окклюзии и дегенерации сосудов сетчатки при диабете. Этот метод позволяет визуализировать и количественно оценить тяжесть лейкостаза в сосудистой сети сетчатки. И он может быть использован в исследованиях, которые хотят оценить эффективность различных методов лечения, включая лекарства.

[Инструктор] Чтобы настроить заварочный узел под давлением, последовательно подключите мешок с 0,9% солевым раствором. набор внутривенных катетеров, четырехходовой клапан запорного крана и игла для зондажа. Откройте систему перфузии и промойте трубопроводы и порты физиологическим раствором в течение двух минут со скоростью потока от 18 до 20 миллилитров в минуту, чтобы удалить любые пузырьки воздуха. Положите мышь, находящуюся под наркозом, в положение лежа на перфузионном столике. Определите мечевидный отросток визуально. Держа гемостат в доминирующей руке, закрепите и зафиксируйте кожу. Затем перенесите кровоостанавливающее средство на недоминантную руку и подтяните кожу. Далее с помощью ножниц отрежьте участок кожи под углом 90 градусов к позвоночнику, чтобы обнажить наружную брюшную стенку. Когда виден мечевидный отросток и грудная клетка, рассекайте с обеих сторон через брюшную стенку, тщательно избегая каких-либо органов или крупных сосудов. Теперь визуализируйте сердце, желудочки и легкие через диафрагму. С помощью кончика ножниц сделайте надрез в диафрагме с одной стороны возле позвоночника. Обнажают сердце в грудной полости после рассечения грудины пополам. Щипцами в недоминантной руке обхватите сердце возле его верхушки. Используя доминирующую руку, удерживайте иглу зондажа, прикрепленную к внутривенному катетеру, и проколите верхушку сердца. Убедитесь, что шариковый кончик иглы для зонда немного выступает из места прокола, чтобы избежать полной перфорации левого желудочка или попадания в легочную сосудистую систему. Затем откройте запорный кран, чтобы дать возможность течь 0,9% физиологического раствора. Одновременно с помощью ножниц разрежьте правое предсердие. Продолжайте перфузию в течение двух-трех минут, осторожно перемещая иглу из стороны в сторону и вверх и вниз, чтобы предотвратить перегибание сосудистой сети и увеличить отток крови от сердца. После перфузии поверните ручку запорного крана, чтобы перекрыть поток физиологического раствора и позволить потоку от шприца к игле для зондирования. Затем вручную перфузируйте 10 миллилитров раствора конканавалина А в течение 30-35 секунд. После перфузии сердца мыши, находящейся под наркозом, раствором конканавалина А, переверните мышь на бок. Поместите указательный палец недоминантной руки на верхнее веко, а большой палец — на нижнее веко. Аккуратно втяните веки и окружающую кожу, чтобы сделать глаз так, чтобы он частично выпячивался из глазницы. Далее, используя изогнутые ножницы в доминирующей руке, зачерпните под глаз под углом 45 градусов. Разрежьте мышечные прикрепления и зрительный нерв. Используя ножницы в качестве шпателя, перенесите глаз в небольшую емкость. Поместите глаз на зубной воск, чтобы подготовиться к открытию шара. Под препарирующим микроскопом с помощью микрощипцов удерживают склеральную складку или остатки мышц, прикрепленные к задней части глаза, и ориентируют глаз так, чтобы роговица была обращена в одну сторону. Сделайте разрез позади и параллельно лимбу. С помощью микроножниц отделите передний отрезок глаза, включая хрусталик по периметру наглазника, убедившись, что сетчатка полностью отделена от склеры. Вычерпните сетчатку из склеры с помощью микрошпателя. Если сетчатка все еще прикреплена зрительным нервом, вставьте микроножницы между сетчаткой и склерой, чтобы перерезать зрительный нерв. Поместите незафиксированную сетчатку на предметное стекло с каплей PBS. Сделайте четыре-пять радиальных надрезов в сетчатке, создавая узор из листьев клевера так, чтобы он лежал ровно. Наблюдайте за плоской сетчаткой глаза под микроскопом при 100-кратном увеличении с использованием 10-кратного объектива. Флуоресцентная микроскопия сосудистой сети сетчатки показала, что у диабетических сетчаток наблюдался легкий лейкостаз с типичным содержанием от 3 до 12 лейкоцитов на сетчатку по сравнению с 1-3 у контрольной группы без диабета. Значительные кластеры лейкоцитов наблюдались в моделях воспаления с липополисахаридами, в отличие от легкой кластеризации в образцах с диабетом.