Моделирование эндотелиального гликокаликса после пневмонэктомии в 3D-жидкостном чипе - подход к изготовлению сосудистой системы орган-на-чипе

Лаборатория Mensah специализируется на сосудистых исследованиях и разрабатывает новые методы исследования эндотелиального гликокаликса и его роли в сосудистых заболеваниях. Последние разработки включают создание более совершенных моделей in vitro для исследований гликокаликса и исследование терапевтических стратегий для улучшения здоровья эндотелиального гликокаликса и восстановления при заболеваниях. К числу экспериментальных проблем относятся неполные модели in vitro, которые не могут точно воспроизвести здоровый гликокаликс, а также сложные методы количественной оценки и измерения.

Наш текущий вклад в эту область расширил современное понимание эндотелиального гликокаликса, в частности, его роли в метастазировании рака, регенерации поврежденного гликокаликса и взаимодействии с рецепторами сосудистой поверхности. Наш метод представляет собой недорогой и эффективный метод создания сосудистых систем типа «орган-на-чипе», экспрессирующих более развитый и биомиметический эндотелиальный гликокаликс по сравнению с традиционными методиками. Для начала взвесьте 10 частей силиконовой эластомерной основы в 50-миллилитровой центрифужной пробирке.

Залейте одну часть отвердителя в пробирку, содержащую основание из силиконового эластомера, до конечного объема 30 миллилитров. Тщательно перемешайте до получения однородного раствора. Теперь разлейте хорошо перемешанный раствор по формам, затем поместите формы в вакуумную камеру для дегазации PDMS в течение 30-60 минут или до тех пор, пока не останутся пузырьки.

Извлеките дегазированный PDMS из вакуумной камеры и дайте ему затвердеть при комнатной температуре в течение 48 часов. Извлеките отвержденный PDMS из формы PLA. Затем поместите по два куска двустороннего скотча в каждую пластину для культивирования клеток.

Затем поместите каждую сосудистую сеть PDMS наполовину поверх ленты в отдельной чашке для клеточной культуры. Поместите несколько капель фибронектина по 30 микролитров вдоль сосудистой сети PDMS с помощью микропипетки. Наклоните PDMS по мере необходимости и используйте наконечник для дозатора для равномерного покрытия поверхности.

После 30-минутной инкубации аспирируйте раствор фибронектина из PDMS. Затем дайте деталям высохнуть на воздухе внутри шкафа. Поместите напечатанные на 3D-принтере заглушки на каждый конец половинки сосудистой сети PDMS, чтобы предотвратить утечку клеточной суспензии, используя две пробки на штуку.

С помощью микропипетки внесите 300 микролитров клеточной суспензии HLMVEC в каждый кусочек PDMS и инкубируйте. Затем верните половинки в шкаф и снимите четыре заглушки. Добавьте питательную среду HLMVEC для погружения половинок сосудистой сети PDMS и снова инкубируйте в течение шести-10 часов.

Теперь отсадите среду HLMVEC из чашки Петри, содержащей половинки сосудистой сети. Поместите каждую половинку PDMS в поликарбонатные блоки, обеспечивая правильное выравнивание. Нанесите силиконовый герметик на концы сосудистой сети PDMS.

Вставьте трубку длиной в дюйм в оба конца нижней части PDMS. Затем переверните верхний акриловый блок, содержащий верхнюю половину PDMS, на нижний акриловый блок. Соедините акриловые блоки болтами друг с другом, убедившись, что резьбовой блок находится внизу.

Закупорьте свободные концы трубки с помощью напечатанных на 3D-принтере заглушек. Удалите одну пробку и аккуратно введите 500 микролитров питательной среды HLMVEC в сосудистую сеть с помощью микропипетки. Наклоните, чтобы удалить пузырьки воздуха, а затем установите на место пробку.

Занесите собранный чип и стерильные компоненты в шкаф биобезопасности. Подсоедините все трубки и соберите проточную систему, убедившись, что входная трубка соединяется с дном резервуара для шприца для облегчения самотечного потока. Теперь аккуратно загрунтуйте проточную систему средой HLMVEC.

Используйте серологическую пипетку объемом 50 миллилитров. Введите 30 миллилитров среды в верхнюю часть резервуара шприца и включите перистальтический насос на низкой скорости, чтобы заполнить трубку. Промойте каждую половинку сосудистой сети PDMS в PBS в течение пяти минут, добавив достаточно раствора, чтобы полностью погрузить сосудистый участок.

Моделирование жидкости показало значительно повышенное напряжение сдвига в бифуркациях сосудов в модели пневмонэктомии по сравнению с контрольной моделью. Светлопольная микроскопия подтвердила равномерное прикрепление клеток HLMVEC как в статических, так и в проточных условиях на уровне 93,1 миллилитров в минуту через 24 часа. Флуоресцентная визуализация входной бифуркации показала неповрежденные и хорошо распределенные клеточные слои как в контрольной модели, так и в модели пневмонэктомии.

Визуализация сразу после второй бифуркации выявила значительную потерю клеток как в контрольной модели, так и в модели пневмонэктомии. Клетки оставались адгезивными и демонстрировали последовательное окрашивание в области после второй бифуркации в обеих моделях. Равномерные ядра, окрашенные DAPI, в сосудистых моделях указывали на то, что слияние сохранялось, несмотря на воздействие потока.

Раннее испытание контрольной модели привело к неравномерному распределению клеток из-за пузырьков воздуха, введенных во время прайминга системы.